“紫娟”茶原花青素提取与聚合度分析

涂云飞，杨秀芳，孔俊豪

(1.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室，浙江杭州 310016；2.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016)

“紫娟”源于云南大叶群体国家级茶树良种，属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)茶[CamelliaSinensis(L.) O.Kuntze]中的普洱茶变种(Camelliasinensisvar.Assamica)，是云南大叶群体种中的一种稀有茶树品种[1]。原花青素(Proanthocyanidins或Procyanidins,简称PC)，主要分布在植物界中，由黄烷醇类化合物单体通过C4—C6或C4—C8共价结合而形成的一类聚合物(图1)，是植物中广泛存在的一大类双黄酮衍生物的天然多酚化合物的总称。这类物质在酸性条件下加热可生成红色的花青素，因而得名。低聚原花青素(2～4个聚合体)的生物适应性好，生物利用度高，毒性很低，具有抗氧化与清除自由基、保护心脑血管系统，有益于心血管健康，可改善餐后动脉粥样硬化风险指数、调节血脂、预防与治疗癌症、糖尿病等作用[2-3]。有研究表明，“紫娟”茶中花青素的含量约是普通茶叶的20倍，但从“紫娟”茶叶中提取原花青素报道较少。鉴于此，笔者通过溶剂提取法从“紫娟”茶中提取出原花青素并探究了其原花青素的平均聚合度。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂Waters高效液相色谱仪[1525双元泵，2487双波长紫外可见检测器，717-plus 自动进样器，Breeze操作控制软件，沃特世科技(上海)有限公司]；紫外可见分光光度计 (尤尼柯上海仪器有限公司)； 旋转蒸发仪 (上海豫康科教仪器设备有限公司)；BPZ-6063真空干燥箱 (上海一恒科技有限公司)；梅特勒 AL-204分析天平 (梅特勒特利多有限公司)。(+)-儿茶素 (上海友思生物技术有限公司)，其余试剂均为国产分析纯。

图1 原花青素二聚体类型与结构Fig.1 Type and structure of dimer proanthocyanidin

1.2方法

1.2.1提取方法。将1.5 g茶粉置于250 mL三角瓶中，加入30 mL 70%乙醇溶液，在不同温度、时间及目数下水浴提取，冷却，抽滤，用水定容至50 mL容量瓶中，待用。

1.2.2儿茶素测定方法[4]。采用国际标准法(ISO 14502—2005E)，并以咖啡碱作为内标法对各儿茶素进行定量分析。将“紫娟”原花青素粗提干物质浓度配制成2 mg/mL，稀释一定倍数后用于儿茶素总量及原花青素聚合度分析。

1.2.3花青素含量测定方法。取一定量花色苷提取液，加入3倍体积的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.0)，混合后于535 nm测量吸光度，并以冰醋酸溶液[50%冰醋酸∶柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液(pH 3.0)=1∶3,V/V]为空白对照。花色苷含量以色度值(Color Value,CV)表示，CV=0.1×吸光度×稀释倍数。

1.2.4原花青素总量及聚合度的测定方法[5-6]。总量采用1 mL样品或儿茶素的甲醇溶液，2.5 mL 2%香草醛甲醇溶液与2.5 mL 1.8 mol/L硫酸-甲醇溶液混匀(体系含水量控制在8%以下)后于30 ℃水浴反应20 min，在500 nm处测定吸光度。

聚合度分析采用含4%浓盐酸及0.5%香草醛的冰醋酸与含样品或不同浓度(+)-儿茶素标准品的冰醋酸以5∶1的体积比混匀后于510 nm处比色测定。

1.2.5蛋白质含量测定方法[7]。采用Bradford方法，取样50 L，加Bradford工作液5 mL，静置2 min，在595 nm处测定吸光度，并加做空白试验作为对照。

1.2.6氨基酸测定方法[8]。取1 mL试液，注入25 mL容量瓶中，加入0.5 mL 0.067 mol/L磷酸氢二钠溶液和0.5 mL 2%茚三酮水溶液(含0.08%氯化亚锡)，于沸水浴中加热15 min，放置10～15 min，于570 nm处测定吸光度。

1.2.7数据处理。数据结果以平均数±标准偏差表示(n=3)，均数差异显著性采用t-test一尾分析。

2 结果与分析

2.1温度、时间及样品目数对有效成分浸提的影响为了有效提取“紫娟”茶中的原花青素等成分，首先考察了温度对其提取过程的影响，以提取液中相应成分的浓度作为参考指标。

由图2可知，随着温度的升高，原花青素、花青素、蛋白质及氨基酸等成分的浸出率逐渐变大，其中原花青素在70 ℃时达到差异极显著水平(P<0.01,t-test; vs.40 ℃)，70 ℃以上变化不明显，同时随着温度的升高，提取过程中乙醇的挥发损耗亦随之增大。虽然花青素、蛋白质及氨基酸相比于40 ℃，在55 ℃即达差异显著水平，但溶液中原花青素的含量变化远高于花青素及蛋白质等成分，表明提高温度可提高原花青素的提取率。

注：*P<0.05;**P<0.01图2 温度对原花青素、花青素、蛋白质和氨基酸浸提的影响Fig.2 The effect of temperature in extracting proanthocyanidin,anthocyanidin and amino acid

在温度调整至70 ℃的前提下，发现随着提取时间的延长(20～60 min)，原花青素在溶剂中的浓度亦增大，60 min以后各成分均未有显著性差异(图3)，其中40 min之前原花青素的提取率还未体现出显著性差异，直至60 min才达显著性水平，而氨基酸则在高温的环境下更有利于浸提。

注：*P<0.05;**P<0.01图3 时间对原花青素、花青素、蛋白质和氨基酸浸提的影响Fig.3 The effect of time in extracting proanthocyanidin,anthocyanidin and amino acid

为进一步考察茶叶粉碎度对其浸提的影响，以上述结果为参照，在提取时间60 min以及提取温度70 ℃的条件下，对原花青素进行提取。由图4可知，目数能够显著提高各成分的浸提率(P<0.01,t-test; 20目 vs.30目)，随后目数的增加对其影响不明显。但过细的粉碎度反而影响后继工艺的放大，并且50～60目反而使花青素的溶液浓度降低，其现象有待进一步分析。

注：*P<0.05;**P<0.01图4 目数对原花青素、花青素、蛋白质和氨基酸浸提的影响Fig.4 The effect of mesh number in extracting proanthocyanidin,anthocyanidin and amino acid

2.2提取物中原花青素聚合度分析原花青素总量及聚合度的分析主要采用儿茶素作为外标法定量。由图5可知，以(+)-儿茶素作为标准品所制备的标准曲线相关系数在浓度为10～320 mg/L、0.017～0.276 μmol/L时均达到良好水平(R2≥0.990 0)，其标准曲线分别为：y=0.001 4x+0.001 0，y=6.692 8x+0.007 2，为后继测定结果准确性提供了保障。

图5 原花青素总量(a)及聚合度(b)的(+)-儿茶素测定标准曲线Fig.5 (+)-catechin standard curve for determining proanthocyanidin gross contents (a) and polymerization degree (b)

由表1可知，“紫娟”茶中儿茶素游离单体总质量分数为18.26%，其总量较大叶种茶提取物偏低[1]，这可能源于大量儿茶素单体一定条件下聚合成原花青素类化合物。鉴于原花青素分解成儿茶素的摩尔数及原花青素的平均摩尔数，其所对应的平均聚合度为3.09，说明“紫娟”茶中的原花青素主要以低聚体存在。另外，由于茶中的儿茶素不仅有简单儿茶素，还含有酯型儿茶素，其分子量为290～458 Da，故“紫娟”茶提取物中原花青素的总质量分数为49.71%～78.51%，平均为64.11%。

表1 “紫娟”茶提取物中儿茶素及原花青素质量分数与摩尔数

注：表中数据基于20 mg样品所得。EGCG为表没食子儿茶素没食子酸酯，EC为表儿茶素，ECG为表儿茶素素没食子酸酯；(A)为利用香草醛分光光度法所测得的总儿茶素单体摩尔数；(B)为(A)除去液相色谱所得各儿茶素组分总摩尔数；原花青素平均摩尔数为冰醋酸所测得的原花青素总摩尔数减去表儿茶素后所得值。

Note：The data acquired in this table based on 20 mg ‘Zijuan’tea extraction.EGCG,EC and ECG represent epigallocatechin gallate,epicatechin,and epicatechin gallate,respectively; (A) represents the value of total moles of catechins acquired by mentioned colorimetric method of vanillin; (B) means the value of total moles of catechins obtained from (A) minus the catechins moles of HPLC method acquired; ‘Average molar of proanthocyanidin’represents the total moles of proanthocyanidin measured by mentioned colorimetric method of glacial acetic acid minus the catechins moles measured by HPLC method

3 讨论与结论

“紫娟”茶中不仅含有丰富的花青素，还含有较多的原花青素，故具有良好的保健功效。试验考察了温度、提取时间及茶样粉碎度对原花青素提取效果的影响，结果表明，随着各指标水平的提升，原花青素含量都有不同程度的增加，其中温度相对于其他指标对原花青素的提取率影响更大。利用(+)-儿茶素外标法所测得的“紫娟”茶提取物中的原花青素的质量分数平均为64.11%，其平均聚合度为3.09，儿茶素的原花青素应以低聚合度的形式存在于“紫娟”茶中。

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