牡荆素保护DNA氧化损伤的活性评价及机制分析

陈 班 李达欢 - 李熙灿 -

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

由活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS)引起的DNA氧化损伤，可以导致细胞的氧化应激，引起基因突变、癌变以及神经退行性病变[1]。羟自由基 (·OH)为ROS中最具杀伤力的自由基，既可以进攻DNA中的鸟嘌呤碱基，生成8-羟基-2′-脱氧鸟嘌呤核苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)，也可以进攻脱氧核糖骨架，生成丙二醛(malondialdehyde，MDA)等产物。8-OHdG与MDA，均是细胞氧化应激的毒性产物[2]。所以， 8-OHdG 已作为重要生物标识物，用于DNA氧化损伤相关疾病的筛查[3]。而脐带血中的MDA含量的检测，可用于判断早产儿的氧化应激状况与DNA损伤的水平[4]。因此，寻找合适的抗氧化剂，保护DNA免受氧化损伤，减少相关毒性产物的生成，已成为自由基生物医学研究的一项重要内容。

前期的研究[5]表明，食用植物中的抗氧化成分主要为多酚类化合物。可食用的多酚主要有黄酮及黄酮苷、类黄酮、双黄酮等，其中以黄酮及黄酮苷最常见。牡荆素(vitexin, apigenin-8-C-glucoside)是一种典型的黄酮类化合物(图1)，存在于山楂等可食用植物中。据文献[6]报道，山楂叶的牡荆素含量为0.04～0.06 mg/g。含有牡荆素的山楂叶总黄酮有抗心肌缺血及再灌注损伤、降低血脂等药理活性，这些药理活性与总黄酮的抗氧化性均有直接关联[7]。

此前，一些零星报道[8-10]提及牡荆素的抗氧化作用，不过，尚未涉及牡荆素对DNA氧化损伤的修复(或保护)活性。本试验拟采用DNA保护能力分析法，研究牡荆素的DNA保护能力；运用Ferrozine法和紫外可见光谱(UV-Vis)法，分析其Fe2+络合反应；运用Cu2+还原法，测定其电子转移ET(Electron-transfer)能力。在此基础上，进一步阐释牡荆素保护DNA氧化损伤可能的化学机制，为牡荆素应用于DNA氧化损伤相关疾病的防治提供依据。

图1 牡荆素结构式Figure 1 The structure of vitexin

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

牡荆素(CAS：3681-93-4)：HPLC≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司；

Trolox(水溶性维生素E)、BHA(丁基羟基茴香醚)、Ferrozine(菲洛嗪)、Neocuproine(新铜试剂)：分析纯，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；

ABTS(2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、鱼精DNA钠盐：分析纯，美国Amresco公司；

KH2PO4、Na2HPO4、Na2EDTA、FeCl3、CuSO4、H2O2、DMSO(二甲基亚砜)、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、抗坏血酸、柠檬酸钠、乙酸铵、甲醇、乙醇：分析纯，广州化学试剂厂。

1.1.2 主要仪器设备

可见分光光度计：2100型，上海尤尼科仪器有限公司；

电子天平：BS110S型，北京赛多利斯科学仪器有限公司；

超声波清洗机：SB3200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

便携式pH计：YSI pH100型，上海维赛仪器贸易有限公司；

恒温水浴锅：DZKW型，北京市永光明医疗仪器厂；

电热恒温鼓风干燥器：DHG-9070A型，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA保护能力分析法 参考文献[11]修改如下，取适量(0，100，150，200，250，300 μL)牡荆素溶液(2 mg/mL，DMSO溶解)至离心管中，挥干溶剂，往其中加入300 μL的KH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液(0.2 mol/L，pH=7.4)和100 μL Na2EDTA溶液(0.25 mmol/L)。随后，依次加入50 μL FeCl3溶液(1.6 mmol/L)，75 μL的H2O2溶液(16.8 mmol/L)和50 μL底物DNA溶液(5 mg/mL鱼精DNA钠盐)。再加入75 μL抗坏血酸溶液(33.6 mmol/L)，补加缓冲溶液，使反应液总体积达到1 050 μL，摇匀，将该离心管置于50 ℃水浴中20 min，取出，再加入250 μL三氯乙酸溶液(100 mg/mL)和150 μL 2-硫代巴比妥酸溶液(50 mg/mL)，于105 ℃烘箱中加热15 min，在532 nm处测定其吸光度值A。试验以Trolox和BHA为阳性对照。按式(1)计算牡荆素对DNA的保护率R。

(1)

式中：

R——DNA保护百分率，%；

A0——未加样品的溶液吸光度；

A——加入样品后溶液的吸光度。

1.2.2 Ferrozine法 参考文献[11]修改如下：取FeCl2溶液(250 μmol/L) 0.1 mL，加适量(0，400，600，1 200，1 600，2 000 μL)牡荆素(0.01 mg/mL，DMSO 溶解)溶液，充分混合后静置3 min，再加入0.8 mL甲醇，0.15 mL Ferrozine (500 μmol/L)溶液，静置5 min后，在562 nm下测定吸光度值A。按式(2)计算牡荆素对Fe2+络合率C。

(2)

式中：

C——Fe2+络合百分率，%；

A0——未加样品的溶液吸光度；

A——加入样品后溶液的吸光度。

1.2.3 Fe2+络合产物UV-Vis光谱分析 参考文献[12]修改如下：取样品溶液(1 mg/mL，DMSO溶解)100 μL，加入100 mg/mL FeCl2溶液300 μL，再加入甲醇水(1∶1)600 μL。在反应0，5，10，20，30，40，50，60，120 min时进行UV-Vis光谱扫描。最后对反应液、样品液和FeCl2溶液进行颜色对比。

1.2.4 Cu2+还原法 参考文献[11]修改如下：取10 mmol/L CuSO4溶液和7.5 mmol/L新铜试剂各125 μL混匀，依次加入牡荆素溶液(0.5 mg/mL，DMSO溶解)xμL(x=150，200，250，300，350)，0.1 mol/L乙酸铵缓冲液(700-x) μL，混合后静置30 min，在450 nm下测吸光度值A。按式(3)计算牡荆素对Cu2+相对还原率S。

(3)

式中：

S——Cu2+的相对还原百分率，%；

A0——未加样品液时所测吸光度；

Amax——一次测量内最大的吸光度；

A——加入样品液时所测吸光度。

2 结果与分析

2.1 DNA保护能力及机制

由于·OH进攻DNA的脱氧核糖部分会生成MDA等毒性物质，从而导致多种疾病的发生[13-15]。因此，抑制MDA的生成，可有效保护DNA免受氧化损伤。通过检测MDA与2-硫代巴比妥酸形成的硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)复合物的含量，可以检测MDA的存在。TBARS在532 nm处有最大吸收。如果A532 nm值降低，则表明MDA的生成得到了有效抑制，DNA在一定程度上受到保护。因此，该模型可用来评估DNA氧化损伤的程度。如图2(a)所示，在0～0.6 mg/mL的浓度范围内，牡荆素的DNA保护能力与其浓度呈现出良好的量效关系。从表1可以看出，其DNA保护能力约为Trolox的2.50倍。这表明，牡荆素能保护DNA免受·OH诱导的氧化损伤。

表1 各个检测指标下样品和阳性对照的IC50值†Table 1 The IC50 values of vitexin and the positive controls

†IC50指被测量的拮抗剂的半抑制浓度；同行不同上标字母表示数据有显著差异(P<0.05)；比值指相应指标下水溶性维生素E或柠檬酸钠的IC50与牡荆素的IC50之比；N.D.指不需测。

图2 牡荆素抗氧化作用的量效关系图Figure 2 The dose response curves of vitexin in various antioxidant assays

2.2 Fe2+络合活性及机制

据文献[16]报道，在H2O2对酒石酸的氧化过程中，Fe2+可以极大提高反应速率，后通过顺磁共振试验(ESR)证实，在此反应体系中，·OH是实际的氧化中间体。在没有金属离子存在时，DNA能对抗浓度约10 mmol/L的H2O2[17]，但只要有皮克级的Fe2+参与反应，就能够使H2O2转化成·OH，从而引起DNA 的氧化损伤[18]。在细胞中，这种催化作用通过Fenton反应(Fe2++H2O2→Fe3++·OH+·OH-)实现[12,19-22]。因此，络合Fe2+可以有效地减少·OH 的生成，从而保护DNA免受·OH诱导的氧化损伤，使细胞能健康成长甚至分化[23]。

从图2(b)中可以看出，在0～7 μg/mL的浓度范围内，牡荆素对Fe2+的络合能力与其浓度呈现剂量相关性。据表1可知，牡荆素、柠檬酸钠的铁络合能力的IC50值分别为(9.3±1.2)，(9.6±2.8) μmol/L，二者没有显著的统计学差异，表明两者的铁络合能力相似。从图3(a)可知，络合产物在200～400 nm 的波长范围内，其紫外吸收强度有一定程度的增加。从图3(b)可以看出，牡荆素在与Fe2+混合的60 min 与120 min 的吸收强度很接近(线条⑧和⑨)，说明该反应在60 min时已基本达到平衡。而在二者混合的瞬间(0 min)，即在554 nm处生成新的吸收峰(线条①)，其强度已超过120 min时(线条⑨)吸收强度的50%，说明牡荆素的Fe2+络合反应是一个快速反应。此时，牡荆素样品溶液由淡黄色变成了黄绿色，其554 nm处摩尔吸光系数ε=2 680.74 L/(mol·cm)。总之，牡荆素对Fe2+有一定的络合作用，该络合作用可能是牡荆素保护DNA免受氧化损伤的机制之一。

牡荆素络合Fe2+的能力，与其分子结构的特点有关。牡荆素分子的4-羰基和5-羟基为共平面构型，Fe2+易在此处构成一个平面的环状结构。因此，牡荆素可能在4-羰基-5-羟基之间存在一个Fe2+络合位点，其络合反应式见图4。由图4 可知，Fe2+在4-羰基-5-羟基之间形成了一个六元环，由于六元环的角张力最小，所以，其Fe2+络合的片段结构是稳定的，与此前的一些报道[18,19,22,24]相吻合。综上，牡荆素的Fe2+络合能力得益于其环状的结构。对于一些链状的脂肪酸(如十六酸)而言，则不可能与Fe2+络合[25-26]；而对于一些环状的倍半萜内酯(如白术内酯[27])而言，由于没有环外的羰基或羟基，同样不能表现出Fe2+络合活性。这反过来印证了：牡荆素络合Fe2+的能力，与分子的环状结构(特别是平面构型的4-羰基-5-羟基)相关。

①～⑨ 分别为0.1 mg/mL牡荆素与30 mg/mL Fe2+络合0，5，10，20，30，40，50，60，120 min后的扫描结果; ⑩ 为0.1 mg/mL牡荆素溶液扫描结果；为30 mg/mL FeCl2溶液扫描结果

图3 牡荆素与Fe2+络合产物的UV光谱图及Vis光谱图

Figure 3 The UV-spectra and Vis-spectra of vitexin

binding to Fe2+complexing

图4 牡荆素络合Fe2+的可能反应Figure 4 The possible reaction of vitexin complexing with Fe2+

2.3 Cu2+还原活性及机制

由图2(c)可知，在0.00～0.16 mg/mL的浓度范围内，牡荆素对Cu2+的还原能力与其浓度呈现出良好的剂量相关性。这表明牡荆素具有一定的Cu2+还原能力。而Cu2+还原本质是一个电子转移的过程[16-18]，因此，在牡荆素保护DNA免受·OH诱导的氧化损伤的过程中，可能涉及到电子转移。

3 结论

牡荆素具有良好的保护DNA免受·OH诱导的氧化损伤的能力。其保护机制可能与电子转移及Fe2+络合有关。其Fe2+络合反应的位点，可能在4-羰基-5-羟基之间。这些抗氧化化学机制的阐释，将推动牡荆素在DNA氧化损伤相关的疾病方面发挥作用。

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