蜂胶复方产品对心肌肥厚改善机制的转录组学研究

孙燕如 - 韩鸣凤 - 沈圳煌 - 吴珍红2, -2, 缪晓青2, -2,

(1. 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；2. 福建农林大学蜂学学院，福建 福州 350002；3. 天然生物毒素国家与地方联合工程实验室，福建 福州 350002)

高血压是世界范围内致死率最高的单因素疾病，会累及心脏、大脑、肾脏等靶器官[1]。由高血压引起的左心室重构是导致心脏衰竭、猝死和心肌梗死的一个独立原因[2]。当心肌负荷增高时，心肌代偿性改变，出现左心室的肥大，最终心肌的不适应性变化发生，导致心肌重构从而引发心脏衰竭。高血压心肌肥厚与重构过程中，心肌细胞坏死、凋亡、自噬，同时，纤维细胞的增殖和细胞外基质的重组会引起心肌纤维化[3]。左心室重构通常表现为心室壁增厚、心肌重量增加和心肌重塑[4]。目前，病理性心肌肥厚的分子机制尚未完全阐明，普遍认为当心脏受到机械牵张、压力负荷、缺血缺氧等刺激时，多个信号通路共同参与到心肌肥厚中，其中胰岛素信号通路是介导病理性心肌肥厚的主要通路[5]，在胰岛素与胰岛素受体结合后，活化的胰岛素受体基质与多个信号转导蛋白相互影响，继而激活了PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路。研究显示，胰岛素受体通路上的基因ERK[6-7]、PI3K、GSK3β[8-9]等都可能是改善心肌肥厚的作用靶点。

用蜂胶、蜂王浆、蜂巢提取液等药食两用的蜂产品与蜂毒按照中药“君臣佐使”的配伍原则可复配制成一种蜂胶复方产品。前期试验[10]证明，在离体蛙心上，该蜂胶复方产品可以增加蛙心收缩力从而改善心脏功能，其正性肌力类似于肾上腺素、可被盐酸普萘洛尔抑制。在慢性心衰大鼠模型上，这一产品可以阻止慢性心衰进程且效果优于临床药物右雷佐生[11]。此外，笔者在临床使用中也发现该产品有降压的功效，但其机制尚不明确。自发性高血压大鼠(SHR)常用于高血压的病理、药理研究，其发病进程类似于人类的原发性高血压[12-13]。因此，考虑选用SHR为高血压大鼠模型，探究该产品对高血压引起的心肌肥厚的改善效果及可能的机制。

本研究拟采用转录组学技术，考察蜂胶复方产品对SHR大鼠心肌基因转录组水平上的差异变化，结合GO分析和KEGG通路分析，找到差异基因富集的主要代谢通路，为该蜂胶复方产品对SHR心肌肥厚的改善作用找到相应机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

蜂毒：意大利蜜蜂蜂毒，福建省神蜂科技开发有限公司；

蜂胶：意大利蜜蜂采集自杨树的蜂胶，福建省神蜂科技开发有限公司；

蜂王浆：油菜浆，福建省神蜂科技开发有限公司；

吐温-80：分析纯，国药化学试剂有限公司；

乙醇、羧甲基纤维素钠：化学纯，国药化学试剂有限公司；

RNA提取试剂盒：TransZol®Up型，北京全式金生物技术有限公司；

反转录试剂盒：TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Kit型，宝生物工程(大连)有限公司；

荧光定量试剂盒：SYBR®Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)Kit型，宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备

PCR仪：720 Thermal Cycler型，美国Thermo Fisher公司；

荧光定量PCR检测系统：CFX384型，美国BioRad公司；

测序平台：Hiseq 2500型，美国Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 蜂胶复方产品的配制

(1) 蜂胶醇提物制备：使用80%乙醇按料液比1∶4 (g/mL)对意大利蜜蜂采集的杨树蜂胶浸提，浸提程序为：40 kHz 超声预处理20 min，60 ℃浸提5 h，室温浸提2 d；对浸提液真空抽滤后，滤液在50 ℃下旋转蒸发浓缩，除蜡操作后55 ℃下真空干燥至恒重，测定总黄酮含量为(302.16±2.33) mg/g。

(2) 蜂王浆醇提物制备：在40 ℃下使用95%乙醇按料液比1∶4 (g/mL)对油菜浆提取3 h，4 000×g离心20 min后，获得上清、对沉淀物继续按上述方法提取2次，最后合并滤液，65 ℃下旋转蒸发浓缩，得到蜂王浆醇提物后冷冻干燥备用，测得蜂王浆醇提物中10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)含量为(21.06±0.32)%。

(3) 蜂巢水提物制备：取意大利蜜蜂陈旧巢脾(使用3年)磨碎，按照料液比1∶5 (g/mL)加水煮沸1 h，过滤后滤渣继续按上述方法处理2次，最终合并3次滤液，除蜡、浓缩、干燥至恒重。

(4) 蜂毒肽的制备：粗蜂毒溶于水后5 000 r/min离心15 min，取上清、冷冻干燥。采用葡聚糖凝胶柱层析法分离蜂毒，以0.1 mol/L 甲酸和甲酸铵缓冲液进行G25柱层析，对其中溶血活性较强的组分再进行G50柱层析，接着以0.02 mol/L 甲酸和甲酸铵缓冲液对分离产物进行G75柱层析，获得电泳纯级的终产物。

(5) 蜂胶复方产品的制备：蜂胶醇提物与蜂巢水提物按1∶1质量比混合，加入2%吐温-80后，添加蜂毒肽使得最终的产品中蜂毒肽含量为0.12%，接着加入与蜂胶醇提物质量相等的蜂王浆醇提物。

1.2.2 动物分组与给药 40只自发性高血压大鼠(SHR)，体重180～220 g，雄性，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2011-0011。将40只大鼠随机分为模型对照组(MC)、蜂胶复方产品低、中、高剂量组(分别为BYL-L、BYL-M、BYL-H)。按照“人与大鼠体表面积比”换算给药剂量，见式(1)。蜂胶复方产品低、中、高剂量分别是临床使用剂量的1，2，4倍，换算成大鼠给药量分别约为0.5，1.0，2.0 g/kg。

(1)

式中：

c——大鼠给药量，g/kg；

m——人给药量，g/kg。

1.2.3 心脏样本处理 各组大鼠给予相应药物5周，于末次给药后断食不断水继续饲养24 h，处死后剖取心脏，称得心脏和左心室质量后投入液氮，-80 ℃保存。通过SPSS v19.0 软件对数据进行统计学分析，从蜂胶复方产品灌胃组中筛选出与MC组差异最大的试验组，进入下一步试验。

1.2.4 心肌转录组测序与结果分析

(1) RNA样品制备与测序：待测组分别选取3只大鼠心脏样本进行RNA提取，富集mRNA，加入fragmentation buffer使其成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作。构建好的文库用HiSeqTM2500型测序平台进行测序。

(2) 差异基因的筛选：在信息分析前对原始数据进行质控，通过数据过滤来减少数据噪音。将组装的转录本数据与参考文件基因组进行比对分析，基因表达量的计算使用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)法利用FDR与log2FC来筛选组间差异基因，筛选条件为FDR<0.05且|log2FC|>1。接着对差异基因进行功能富集分析与KEGG代谢通路分析。

(3) 功能富集及KEGG代谢通路分析：将差异表达基因向Gene Ontology(GO)数据库(http://www.geneontology.org/)的各term映射，并计算每个term的基因数，然后用超几何检验，找出与整个基因组背景相比、在差异表达基因中显著富集的GO条目。将DEGs注释到KEGG数据库中，根据KEGG数据库信息对DEGs进行KEGG通路注释。

(4) qPCR对转录组结果的验证：从DEGs中随机挑选9个基因，通过qPCR结果来验证RNA-Seq结果的可靠性。基因引物由广州基迪奥生物技术有限公司设计并合成。RNA提取方法如前所述，接着，根据说明书操作，使用PrimeScript RT reagent Kit将总RNA反转录成cDNA。接着，用SYBR染料法在Step One Plus Real-Time PCR System 上完成qPCR操作。以GADPH为内参基因，使用2-△△ct法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 蜂胶复方对SHR左心室指数的影响

给药5周后，各组大鼠的心脏指数与左心室指数见表1，与MC组相比，BYL-H组的左心室指数有显著差异(P<0.05)，而其他几个给药组虽然在左心室指数和心脏指数上有不同程度的减轻，但均无显著差异(P>0.05)。因此，分别从MC组和BYL-H组中随机选取3只大鼠的心脏进行转录组测序。

2.2 Illumina测序数据质控与评估

对MC组和BYL-H组样本Illumina测序，过滤后获得的有效读段均在95.82%以上，两端Q30在89.5%以上，过滤后的数据有88.42%以上能比对到参考基因组上(表2)，表明测序数据质量较高。

2.3 DEGs的GO分析

与MC组相比，从BYL-H组筛选出1 297个DEGs，其中91个DEGs上调、1 206个DEGs下调。对所有DEGs进行GO注释，包括分子功能、细胞组分、生物过程三类。在生物过程中，注释到发育进程(developmental process)、生物黏附(biologicaladhesion)、运动(locomotion)、细胞成分组织或生物发生(cellular component organization or biogenesis)、定位(localization)、代谢进程(metabolicprocess)、单一机体进程(single-organismprocess)、生物调节(biological regulation)、细胞进程(cellular process)、生长(growth)、免疫进程(immune system process)、应激反应(response to stimulus)、信号传递(signaling)、生殖(reproduction)、多种机体进程(multi-organism process)、行为(behavior)、多细胞生物过程(multicellularorganismalprocess)的DEGs数目分别为410，116，138，351，346，593，720，444，886，69，147，469，403，84，34，1，152(图1)。

表1蜂胶复方产品对SHR心脏指数与

左心室指数的影响†

Table 1 Effect of the propolis product on heeart index and left ventricular index in SHRs (n=10)

组别左心室指数组别左心室指数MC0.280±0.015BYL-M0.276±0.014BYL-L0.280±0.010BYL-H0.267±0.013*

† *表示与模型组相比，P<0.05。

表2 测序数据分析Table 2 Analysis of transcriptome sequencing data

1. 行为 2. 生物黏附 3. 生物调节 4. 细胞成分组织或生物起源 5. 细胞进程 7. 生长 8. 免疫进程 9. 定位 10. 运动 11. 代谢过程 12. 多种机体进程 13. 多细胞生物过程 14. 生殖 15. 应激反应 16. 信号传递 17. 单一机体进程 18. 细胞 19. 细胞连接 20. 细胞组件 21. 细胞外基质 22. 细胞外基质成分 23. 胞外区 24. 细胞外区域部分 25. 离子配合物 26. 细胞膜 27. 细胞膜零件 28. 细胞膜内腔 29. 细胞器 30. 细胞器零件 31. 突触 32. 突触零件 33. 结合 34. 催化活性 35. 分子传感器活性 36. 分子功能调节器 37. 核酸结合转录因子活性 38. 信号传感器活性 39. 结构分子活性 40. 转录因子活性，蛋白质结合 41. 转运活性

图1 GO term分类结果

Figure 1 Results of GO term classification

2.4 DEGs的KEGG富集分析

不同基因之间相互协调，方得以行使生物学功能，基于pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。对所有DEGs进行KEGG富集，共有410个DEGs(24个上调、386个下调)可富集到KEGG数据库，说明给予蜂胶复方产品后引起了多个代谢通路的变化，图2列出了差异最显著的前20个pathway。在前10个pathway中，富集到黏着斑、胰岛素信号通路、长寿调节通路-多个物种、长寿调节通路-哺乳动物、细胞外基质受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、唾液分泌、背腹轴形成、MAPK信号通路的DEGs数目分别为36，24，15，18，17，39，28，14，8，31，提示该蜂胶复方产品可能在炎症反应、能量代谢、信号转导等方面对SHR心肌产生影响。有趣的是，DEGs富集较多的3个代谢通路——PI3K-Akt信号通路、胰岛素信号通路、MAPK信号通路是介导病理性心肌肥厚的主要通路[5]。PI3K-Akt信号通路和MAPK通路是胰岛素和胰岛素受体结合后，经不同信号蛋白转导而激活的两个主要通路，与胰岛素信号通路密切相关，提示蜂胶复方产品可能通过影响胰岛素相关信号通路而改善SHR心肌肥厚。

图2 差异基因富集显著的前20个KEGG富集图Figure 2 Top 20 KEGG enriched graph with significant DEGs

2.5 胰岛素信号通路相关基因的筛选

图3是胰岛素信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路重叠基因的韦恩图。3个通路共同的DEGs是mitogen activated protein kinase 1 (MAPK1)；胰岛素信号通路与PI3K-Akt通路共同的DEGs为：phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1(Pik3r1)、protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2 (Prkaa2)、insulin receptor substrate 1 (Irs1)、glycogen synthase kinase 3 beta (Gsk3b)、3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 (Pdpk1)、tuberous sclerosis 1(Tsc1)；胰岛素信号通路与MAPK通路共同的DEGs为：crk-like protein-like、CRK proto-oncogene, adaptor protein (Crk)、protein kinase cAMP-activated catalytic subunit beta (Prkacb)。与MC组相比，以上各差异基因在BYL-H组中均为下调(表3)。

胰岛素信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK通路共同的DEG为MAPK1，即ERK2。心肌肥厚的过程中，心脏的机械负荷增加，局部和系统的神经体液因子、细胞因子和生长因子增加，机械和神经内分泌的效应器通过伸展、G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶来诱导多种细胞内信号包括细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)路的激活[14]。由于大多数刺激引起心肌肥厚的刺激，也会在ERK1和ERK2激酶激活环内引发一种急性磷酸化作用，导致它们的激活，因此ERKs长期以来被认为是心脏肥大的促进剂[14]。在本试验中，BYL-H心肌的ERK2的表达量与MC组的相比，显著降低，与异钩藤碱[6]、法舒地尔[15]等降低ERK2mRNA表达量、改善心脏功能的结果一致。

胰岛素和胰岛素受体结合会导致胰岛素受体底物(IRS)的酪氨酸磷酸化，激活的胰岛素受体与IRS和其他蛋白相互作用，激活包括PI3K-Akt和MAPK通路在内的多个通路。心脏中，IRS1和IRS2是表达量最高的IRS蛋白，对胰岛素调控激活PI3K起重要作用[16]。PI3K由p110催化亚基和p85调控子单元组成，催化生成脂质产物PIP3，进而导致PDK1调控的Akt的激活。Akt通过磷酸化蛋白来调节各种细胞过程，在心脏中表达最多的是Akt1和Akt2，前者主要调控体细胞生长，后者主要与代谢相关。由Akt介导的磷酸化作用抑制了GSK3β活性，从而促进了心脏肥大和糖原的合成；Akt介导调节的TSC1磷酸化可调控mTOR的激活，而mTOR激活后可促进蛋白质的合成。胰岛素信号通路中，与IRS相互作用的其他转导蛋白包括GRB2，GRB2是导致MAPK激活的SOR、RAS、RAF和MEK串联的一部分，MAPK通路在细胞增殖、分化、迁移中起着重要作用。在试验中，BYL-H组心脏样本中的IRS1、PI3Kγ、GSKβ等胰岛素信号通路与PI3K-Akt信号通路的重要基因的表达量相较于MC组明显下降。PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，调节细胞功能。PI3K有多个亚型，其中PI3K-α和γ在心脏中表达、且发挥重要作用，抑制PI3K-γ可保护心衰时β1-AR下调而改善心肌功能[17]。GSK3β是多种重要信号转导过程中起关键作用的酶[18]。心肌肥大过程中，细胞外刺激信号激活了PI3K-Akt通路中的Akt，造成其下游GSK3β磷酸化、导致GSK3β的失活，进而导致心肌肥大的发生。GSK3β在Tyr216位点磷酸化时，GSK3β活性增加，而在Ser9位点磷酸化时，GSK3β活性受到抑制，活化的GSK3β可以阻止心肌肥厚的发展[19]。转录组数据表明，当灌胃蜂胶复方产品后，GSK3β在SHR心肌中的表达量下降了，但GSK3β的活性是否改变、如何改变需要进一步研究。

3个KEGG通路分别是：Insulin，胰岛素信号通路；PI3K-Akt，PI3K-Akt信号通路；MAPK，MAPK信号通路

图3 DEGs富集数目最多的前3个KEGG通路中重叠的基因 Figure 3 Overlapping genes in the top 3 KEGG pathway表3 胰岛素信号通路与PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路的重叠DEGsTable 3 Overlapping DEGs of insulin signaling pathway with PI3K-Akt signaling pathway and/or MAPK pathway

2.6 qPCR验证结果

为证实RNA-Seq数据的可靠性，随机挑选9个基因进行qPCR验证。这9个基因分别是Gadd45g(Gene ID: 291005 )、MAPK1 (Gene ID: 116590)、Eif4g1 (Gent ID: 287986)、Otud1 (Gene ID: 498803 )、Clic4 (Gene ID: 83718)、Usmg5 (Gene ID: 103693430)、Mt-nd4 (Gene ID: 26201)、Mt-nd3 (Gene ID: 26199 )、Mt-atp6 (Gene ID:26197)。如图4所示，经qPCR验证，这些被选基因的相对定量表达模式与RNA-Seq测序结果一致，表明测序结果是可靠的。

3 结论

本试验以SHR为受试动物，通过左心室指数的计算确定蜂胶复方产品对心肌肥厚的干预效果，及药效最佳剂量组(BYL-H组)。接着使用RNA-Seq技术对BYL-H组和MC组的转录组数据进行分析，找出了1 297个DEGs，将这些DEGs进行KEGG代谢通路富集分析，发现富集到与胰岛素代谢相关的几个通路(即胰岛素信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路)上的DEGs数目较多，提示蜂胶复方产品可能通过调节胰岛素代谢通路改善SHR的心肌肥厚，而在胰岛素信号通路上对ERK2、PI3K-γ等下调表达的效果可能是蜂胶复方产品作用到SHR心肌肥厚的靶点。

图4 基因相对定量结果Figure 4 Relative gene expression levels of candidate genes. Data from qPCR and RNA-Seq both are means of three replicates

后续研究还可以从该蜂胶复方产品对ERK2、PI3K-γ等基因的磷酸化和非磷酸化蛋白的表达水平差异入手，对相关基因的激活或抑制情况作进一步探究。

[1] MENSAH G A, CROFT J B, GILES W H. The heart, kidney, and brain as target organs in hypertension[J]. Curr Probl Cardiol, 2003, 28(2): 156-193.

[2] KATHOLI R E, COURI D M. Left ventricular hypertrophy: major risk factor in patients with hypertension: update and practical clinical applications[J]. International Journal of Hypertension, 2011, 2 011: 1-10.

[3] SCHIRONE L, FORTE M, PALMERIO S, et al. A review of the molecular mechanisms underlying the development and progression of cardiac remodeling[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2017, 2 017: 3 920 195.

[4] 刘丽娜, 李法琦. 心肌肥厚相关信号通路的研究进展[J]. 重庆医学, 2010(20): 2 805-2 808.

[5] 张勇涛, 蒋凡. 生理性和病理性心肌肥厚的信号传导机制[J]. 中华心血管病杂志, 2015, 43(3): 277-280.

[6] 徐洋, 李强, 侯化化, 等. 异钩藤碱通过下调CaN、ERK2和上调MKP-1的表达抑制大鼠心肌细胞肥大[J] . 遵义医学院学报, 2013, 36(3): 210-217.

[7] 吴赛, 姜月华, 杨传华, 等. 半夏白术天麻汤对痰湿壅盛型高血压大鼠心肌MAPK信号通路的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2016(8): 159-165.

[8] 叶强, 陈良海, 刘应才, 等. 辛伐他汀通过Akt/GSK3β通路抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡[J]. 中国药理学通报, 2011(12): 1 656-1 660.

[9] 薛一涛, 陈炜, 刘鹏, 等. 复心汤对心力衰竭大鼠PI3K-Akt-GSK3β通路的影响[J]. 上海中医药杂志, 2015(8): 74-78.

[10] 刘婕, 高虹, 缪晓青. 宝元灵对离体蛙心脏收缩功能的影响[J]. 华西药学杂志, 2014(2): 140-142.

[11] LIU Jie, GAO Hong, FU Ming-ju, et al. Therapeutical efficacy of bee venom compound preparation bao yuan ling on rats with chronic heart failure[J]. Journal of Animal and Veterinary Advances, 2014, 13(13): 801-806.

[12] TRIPPODO N, FROHLICH E. Similarities of genetic (spontaneous) hypertension. Man and rat[J]. Circulation Research, 1981, 48(3): 309-319.

[13] FROHLICH E D. Is the spontaneously hypertensive rat a model for human hypertension?[J]. Journal of Hypertension Supplement Official Journal of the International Society of Hypertension, 1986, 4(4): S15-S19.

[14] MUTLAK M, KEHAT I. Extracellular signal-regulated kinases 1/2 as regulators of cardiac hypertrophy[J]. Frontiers in Pharmacology, 2015, doi: 10.3389/fphar.2015.00149.

[15] 程杰坤, 孙小慧, 高莉萍, 等. 法舒地尔对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥厚的干预作用及其机制[J]. 中国应用生理学杂志, 2016, 32(5): 414-418.

[16] RIEHLE C, ABEL E D. Insulin Signaling and Heart Failure[J]. Circulation Research, 2016, 118(7): 1 151-1 169.

[17] 范婷婷, 刘琼. 姜黄素对脂多糖诱导的心肌功能障碍小鼠PI3K-γ表达的影响[J]. 重庆医科大学学报, 2014(10): 1 368-1 372.

[18] MICHAEL A, HAQ S, CHEN Xin, et al. Glycogen synthase kinase-3βregulates growth, calcium homeostasis, and diastolic function in the heart[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(20): 21 383-21 393.

[19] SUGDEN P, FULLER S, WEISS S, et al. Glycogen synthase kinase 3 (GSK3) in the heart: a point of integration in hypertrophic signalling and a therapeutic target? A critical analysis[J]. British Journal of Pharmacology, 2008, 153: S137-S153.