植物乳杆菌DMDL 9010制剂调控SD大鼠脂质水平的研究

郭 均,黄燕燕,刘冬梅,*,孙丽娜,冯立科,杨爱君,彭小霞,吴 晖,李 理

(1.华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640; 2.广东燕塘乳业股份有限公司,广东广州 510640)

随着人们生活水平的提高,心血管疾病患病率和死亡率正逐年上升,成为当前导致人类死亡的最主要原因之一,占全球总死亡人数的29%[1]。流行病学和临床研究表明,血清中的胆固醇被认为是诱发冠心病动脉粥样硬化等心血管疾病的主要危险因素,血清胆固醇含量每增加l%,患冠心病等心血管疾病的风险就提高约3%,相反,血清胆固醇水平下降l%,患冠心病的几率就可减少2%～3%[2]。高胆固醇血症的特征是血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的增加,其中一个最快的治疗方法是控制血清中胆固醇和甘油三酯[3-4]。临床上治疗高胆固醇血症的方法主要包括膳食干预和药物治疗,但他汀类、烟酸类及衍生物、贝特类、胆酸螯合剂等临床常用药物都存在使血清转氨酶升高、造成肝毒性等不良反应,需长期服用药物,费用较高,病情易反复。因此,寻找能够调节血清胆固醇含量,缓解并治疗高胆固醇血症的生物制剂具有十分广阔的应用前景。越来越多的人们采用降胆固醇益生菌制剂来降低高胆固醇血症和冠状动脉疾病的风险[4]。研究表明,胆盐水解酶(BSH)活性被认为是降低胆固醇的关键因素[5-6]。

L.plantarumDMDL 9010是本课题组从陈年泡菜中分离而得,其降低体内血清胆固醇的能力是未知的。因此,本研究采用体外筛选所得的优良菌株(L.plantarumDMDL9010)应用于高脂饲料喂养的SD大鼠体内,采用边造模边灌胃乳酸菌菌悬液的方法来研究高剂量(109CFU/mL)[18]和低剂量(107CFU/mL)乳酸菌菌悬液对大鼠血脂水平、肝脏大体形态及病理切片、肝脏和粪便脂质水平的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

L.plantarumDMDL 9010[17]课题组从陈年泡菜中分离得到的[17],保藏号CGMCC 5172,于2011年其首次被鉴定为戊糖乳杆菌DMDL 9010,其16S rDNA基因库登录序列号为KJ 917253。

雄性SD(Sprague Dawley)大鼠 8周龄，SPF级，50只,体重160～200 g,南方医科大学动物实验中心,许可证号SYXK(粤)2012-0081,合格证编号440021000;基础饲料 蛋白质20%,脂肪4.2%,碳水化合物50%,中山大学动物实验中心提供;高脂饲料 猪油10%,胆固醇1%,胆盐0.2%,基础饲料88.8%,混匀造粒,在饲喂大鼠之前进行辐照杀菌。

海藻糖 广州卯林试剂有限公司;福尔马林、无水乙醇、二甲苯、盐酸 天津市科密欧化学试剂开发中心;抗坏血酸 广州齐云生物技术有限公司;甘油三脂TG、总胆固醇TC、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C试剂盒 中生北控生物技术股份有限公司;总胆汁酸TBA试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司;其他试剂 分析纯。

YXQ-LS-18SI立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅公司;氮吹仪EFGC-11155 Organo-mation Associates,Inc;全自动生化分析仪HITACHI 7180 Hitachi high-Tech Science Systems Co.,Ltd。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种冻干粉制备L.plantarumDMDL9010菌株于37 ℃、pH6.8的条件下在盛有MRS肉汤培养基的发酵罐中生长18 h。通过8000 r/min(4 ℃)离心15 min后倒去上清液收集菌泥,在无菌操作条件下,按海藻糖(10%,m/V)与菌泥的体积比为1.5∶1的比例加入,于-40 ℃条件下预冻5 h,使其均匀冻结在容器内壁上,进行真空冷冻干燥18～20 h 后,复水测定其活菌数为9.30×109CFU/g。

1.2.2 动物实验与分组 50只SPF级雄性SD大鼠自由摄食饮水,适应性喂养7 d后按照体质量分为5组,饲料喂养及灌胃按照表1所示。大鼠饲喂70 d,每天上午9点灌胃,保证充足的食物和饮水。每7 d对50只大鼠称质量并收集大鼠粪便样品,计算食物消耗量,根据体质量调整给药容积。取1.2.1 所制备的L.plantarumDMDL 9010冻干粉按照1∶1 (g/mL)溶解于经灭菌处理后的生理盐水中制得含109CFU/mL菌量的L.plantarumDMDL 9010悬浮液。同理,取1.2.1所制备的L.plantarumDMDL 9010冻干粉按照1∶100 (g/mL)溶解于经灭菌处理后的生理盐水中制得含107CFU/mL菌量的L.plantarumDMDL 9010悬浮液。

表1 实验动物分组及饲养方式Table 1 Experiment animal grouping and feeding

1.2.3 大鼠食物摄取和体质量指标 70 d动物实验期间,每天观察受试小鼠的生长状态,每7 d称量大鼠体体重1次,并分别在实验第7、14、21、28、35、42、49、56、63、70 d称重喂食量和剩余食量,计算日摄食量,并计算饲料利用率,如公式(1)所示:

式(1)

1.2.4 样本采集 分别在实验开始后第28、56、70 d,禁食不禁水12 h后,每组大鼠随机抽取5只,28、56 d的大鼠剪尾取血,70 d的大鼠处死后腹腔取血,以上血样均37 ℃放置1 h,4 ℃放置2 h,于4 ℃、3000 r/min离心10 min,制备血清,-20 ℃保存。

1.2.5 大鼠脂质水平的测定

1.2.5.1 大鼠血脂水平的检测 按照试剂盒说明书要求测定血清中总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量,并计算动脉粥样硬化指数(atherosclerotic index,AI),如公式(2)所示:

式(2)

1.2.5.2 大鼠肝脏脂质水平的检测 实验70 d处死大鼠分离肝脏,称重后取肝左叶,经脱水,常规石蜡包埋、切片,HE染色,用LEICA DM5000B普通光学显微镜观察(×400)。根据Folch等[19]方法提取肝脏脂质。将一片肝(50 mg)置于试样瓶中,加入10 mL氯仿∶甲醇(2∶1,V/V)混合液,振荡混匀,37 ℃保温30 min,离心(80000 r/min,10 min,4 ℃),收集氯仿层至新EP管中,加6 mL生理盐水,离心(80000 r/min,10 min,4 ℃)。重复1次上述步骤后,收集底层氯仿层液体,用氮吹仪吹干,加入异丙醇:Triton-100(9∶1,V/V)混合液0.8 mL复溶,漩涡振荡2 min,加1.2 mL蒸馏水,再漩涡振荡2 min所得溶液为提取的肝组织总脂。按照试剂盒说明书要求测定大鼠肝脏TC、TG含量。

1.2.5.3 大鼠粪便中脂质水平的检测 在第70 d连续3 d收集大鼠的粪便并干燥至恒重,大鼠粪便中总脂肪提取方法同1.2.5.2所示。参照Carr等[20]方法提取大鼠粪便中胆汁酸(TBA):称取0.5 g干粪用10 mL无水乙醇80 ℃提取3次,蒸干后加10 mL石油醚溶解,弃上清,将沉淀用10 mL含2% Triton X-100的乙醇溶解,振荡15 min,取上层液于90 ℃下蒸干得沉淀,最后用10 mL蒸馏水溶解,所得溶液为提取的粪便总胆汁酸。按照试剂盒说明书要求测定大鼠粪便中TC、TBA含量。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 L. plantarum DMDL 9010对大鼠生长状态和体重的影响

从表2可以看出,大鼠的初始体重和血脂差异不显著(p>0.05),大鼠的日体重增加在3.34～3.85 g/d之间,日均摄食量在24.19～26.36 g/d,饲料利用率在13.89～15.13%之间,各实验组之间无显著性差异(p>0.05)。相比模型组,DMDL 9010高组的日均体重增加量和饲料利用率都较低,而DMDL 9010低组的日均摄食量和饲料利用率都较高,原因可能是灌胃的高剂量的乳酸菌增加了肠道菌群,改善了肠道环境,从而减轻了大鼠的肥胖程度,而灌胃低剂量的乳酸菌增加了肠道蠕动,增强了食欲。Lee等[21]研究发现植物乳杆菌具有良好的耐酸、耐胆盐和胆盐水解酶活性的能力,这表明该菌株通过胃通道并到达小肠中能够生存,从而表明实验动物呈现出类似的生长发育模式,也说明L.plantarumDMDL 9010对大鼠并没有毒副作用,与Park等[22]的研究结果一致。

表2 各组实验大鼠的摄食量和饲料利用率(M±SD,n=10)Table 2 Food intake and food efficiency of experimental rats

2.2 L. plantarum DMDL 9010对大鼠血脂水平的影响

在70 d实验期间,血清中的TC、TG、HDL-C和LDL-C水平变化示于表3所示。

表3 实验SD大鼠血脂水平的比较(mmol/L)Table 3 Comparison of the serum lipid levels in experimental SD rats(mmol/L)

28 d时DMDL 9010高组和DMDL 9010低组的血清TC均介于模型组和正常组之间,且DMDL 9010高组的TC相对模型组具有显著性降低(p<0.05);56 d时DMDL 9010高组的血清TC相对模型组降低了23.03%,并且差异显著(p<0.05);70 d时DMDL 9010高组血清TC水平稍低于模型组(p<0.05)。结果说明:一定剂量的L.plantarumDMDL 9010可以显著降低机体血清TC含量,并随摄入时间的延长,该作用更稳定。

28 d时,模型组的血清TG相比于正常组有所增加,而阳性组、DMDL 9010高组和DMDL 9010低组的血清TG水平与正常组类似;56 d和70 d喂养后DMDL 9010高组和DMDL 9010低组的TG与模型组有较轻微的降低且无太大的差别,DMDL 9010高组的血清TG含量最低,但是各组之间并无显著性差异(p>0.05)。结果说明，L.plantarumDMDL 9010的摄入随着摄入时间的延长降低机体血清TG含量的作用具有一定的效果,但效果并不显著。

28 d时各实验组的血清HDL-C结果差异不显著(p>0.05)。56 d时相对于模型组,DMDL 9010低组的血清HDL-C含量下降10.91%,但差异并不显著(p>0.05)。70 d时相对正常组,模型组的血清HDL-C含量具有显著性降低,阳性组、DMDL 9010高组和DMDL 9010低组相对模型组的HDL-C有一定程度的升高,但没有显著性差异(p>0.05)。结果说明:摄入L.plantarumDMDL 9010未能引起HDL-C水平的显著变化,这可能与该菌的降胆固醇机制有关,但摄入一定量的L.plantarumDMDL 9010可能对维持机体HDL-C水平具有一定作用。这与Fukushima等[23]和Chiu等[24]的研究结果一致,Fukushima和Chiu研究植物乳杆菌、干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌均具有降低HDL-C的作用。28 d时模型组血清LDL-C相对正常组具有显著性升高(p<0.05),相对于模型组、DMDL 9010高组和DMDL 9010低组的血清LDL-C含量有所下降,但无显著性差异。56 d和70 d时DMDL 9010高组和DMDL 9010低组的血清LDL-C均介于模型组和正常组之间,血清LDL-C相对于模型组分别降低37.31%和28.00%(p<0.05)。结果说明:摄入L.plantarumDMDL 9010短期内可以降低机体血清LDL-C水平,尽管随着时间的延长效果并不明显,重要的是L.plantarumDMDL 9010可控制血清LDL-C水平。

按照1.2.5.1的公式计算五组大鼠的动脉粥样硬化指数(AI),分析其随灌胃时间变化情况,结果如图1所示。实验开始前和实验第28 d时,各实验组大鼠的AI没有显著差异。但随着实验继续进行,第56 d和第70 d时,各高脂饮食喂养组的AI均明显高于普通饲料喂养组,且有显著性差异(p<0.05),说明长期饲喂高脂饲料可能会增加SD大鼠动脉硬化的几率。比较发现,在实验第56 d和第70 d时,灌胃高剂量L.plantarumDMDL 9010菌悬液的AI低于高脂模型组。结果说明，L.plantarumDMDL 9010的摄入可能具有一定的调节动脉硬化的功效,从而降低机体动脉粥样硬化的风险,且具有持续性。

图1 植物乳杆菌DMDL 9010对实验组大鼠的动脉粥样硬化指标的影响Fig.1 Effect of L. plantarum DMDL 9010 on the atherosclerosis index of experimental rats

2.3 肝脏病理切片观察

各实验组大鼠肝脏病理切片经HE染色,在光学显微镜(×400)下观察结果如图2所示。正常组大鼠肝细胞无脂肪变性,肝组织结构完整、清晰,细胞界限清楚,呈索状排列。高脂模型组出现中到重度程度的小泡性脂肪变性,肝脏内脂肪含量增高,细胞排列紊乱。DMDL 9010高组大鼠肝脏变性有一定程度上地减轻,表现为脂变肝细胞数量减少,脂滴减少或消失,其中DMDL 9010低组与阳性组的类似,DMDL 9010高组脂肪变性的修复最为明显。结果表明1 mL(100 g bw d)的阿托伐他汀和109CFU/mL的L.plantarumDMDL 9010悬浮液对高脂饮食大鼠的脂肪变性具有良好的改善作用。

图2 各实验组大鼠肝脏病理切片观察(×400)Fig.2 Pathological examination of hepatic tissue slices from experimental rats

2.4 L. plantarum DMDL 9010对大鼠肝脏和粪便中血脂水平的影响

2.4.1L.plantarumDMDL 9010对大鼠肝脏血脂水平的影响 各实验组大鼠的肝脏脂质检测结果如图3所示。高脂饲料喂养的模型组大鼠肝脏中TC和TG水平高于普通饲料喂养的正常组,具有显著性差异(p<0.05),说明饮食来源中过高的胆固醇会在肝脏中蓄积。乳酸菌组的TC较模型组有所降低,其中阳性组、DMDL 9010高组和DMDL 9010低组大鼠肝脏TC含量较模型组分别降低了20.57%、33.20%和24.48%(p<0.05),说明阿托伐他汀和L.plantarumDMDL 9010都能有效抑制肝脏中TC的蓄积。阳性组和乳酸菌组的TG较模型组有所降低,其中DMDL 9010高组的TG较模型组降低40.86%,具有显著性差异(p<0.05),说明高剂量DMDL 9010对降低肝脏中甘油三酯的效果较为明显。

图3 实验组大鼠肝脂肪含量Fig.3 Hepatic lipid content in experimental rats

2.4.2L.plantarumDMDL 9010对大鼠粪便血脂水平的影响 各实验组大鼠粪便中TC和TBA含量如图4所示。各高脂饲料喂养的实验组大鼠的粪便胆固醇含量均明显高于普通饲料喂养的正常组,且有显著性差异(p<0.05),说明饮食中含量过高的胆固醇无法被吸收,随粪便排出体外。阳性组和DMDL 9010高组相对模型组显著升高,阳性组和DMDL 9010高组由粪便排出的胆固醇分别高出模型组18.82%、23.70%,说明阿托伐他汀和高剂量植物乳杆菌DMDL9010能够促进胆固醇的排泄。由于胆固醇是合成TBA的前体物质,促进TBA在肠道的排泄是降低体内胆固醇代谢的主要途径。比较发现高脂饲料喂养的大鼠粪便的胆汁酸含量均高于普通饲料喂养的正常组,且乳酸菌组大鼠TBA的排泄量比模型组都显著升高(p<0.05),其中DMDL 9010高组TBA代谢量较模型组高出70.18%,说明灌胃高剂量DMDL9010菌悬液能有效增加大鼠TBA的排泄量,从而减少血清中胆固醇含量。

在我们的研究中,DMDL 9010高组大鼠的粪便TC和TBA的变化可能是L.plantarumDMDL 9010抑制胆汁盐的在肝肠中循环吸收引起的。饮食中补充胆固醇会导致在其在肝脏中的积累,从而导致增加动脉粥样硬化指数和心血管疾病的风险。此外,L.plantarumDMDL 9010可浸润肝细胞的脂肪,并一定程度的降低囊泡脂肪变性,该发现与Xie等[25]的研究是一致的。病理切片清楚地指出肝细胞的脂质在减少(图2),而且DMDL 9010高组和DMDL 9010低组肝脏中TC和TG水平显著下降(表3)(p<0.05)。粪便中TC和TBA的排泄变化指出与摄入L.plantarumDMDL 9010有显著关系(图4),过多的胆固醇主要是消除通过转化为胆汁酸。该结果表明,L.plantarumDMDL 9010可能在通过增加粪便的TC和TBA的含量从而有效抑制胆固醇的积累。肝脏中TC可促进血清胆固醇的进入,从而降低血清胆固醇(见图1)。之后胆固醇转化成胆汁酸,借助于肝肠循环,大多数结合TBA重吸收,而未结合的则排入粪便。如果TBA重吸收时由于L.plantarumDMDL 9010而受阻,那么更多的TBA会在粪便排出体外,而少量将被回收到肝脏。因此,L.plantarumDMDL 9010降低胆固醇水平可能是由于在肝肠循环过程中TBA重吸收被抑制,从而成为游离TBA在粪便中排出体外。L.plantarumDMDL 9010的降胆固醇效果可能是由于增加了粪便TC和TBA,而不是将胆固醇从血液转移到肝脏,这些结果与Park等[22]研究相似。

图4 实验组大鼠粪便中胆固醇和胆汁酸含量Fig.4 Fecal lipid content and total bile acid in experimental rats

3 结论

L.plantarumDMDL 9010是一种通过在SD大鼠中降低血清TC和LDL-C的浓度并增加肝胆固醇和粪便TBA的排出,从而降低与胆固醇有关的心血管疾病的风险的益生菌。因此,SD大鼠的肝脏形态学变化和肝组织病理学切片观察可以验证该效果。植物乳杆菌DMDL 9010也显著地表现出亚硝酸盐降解能力,这表明L.plantarumDMDL 9010与健康的肠道环境息息相关。该微生物的亚硝酸降解产物有参与胃肠系统,包括保持血管张力、参与免疫反应、传递神经信号和放松肠平滑肌的许多生理功能。因此,我们可以推断,L.plantarumDMDL 9010是提高肝肠循环的益生菌,同时将需要进一步的研究验证L.plantarumDMDL 9010在人体中的作用。此外,潜在的机制可能是不同的,并需要通过探索转录因子、胆固醇受体、参与这一脂质稳态关键酶来验证可能的机制。

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