肥胖人群肠道菌群多样性研究

摘 要：为了探讨肥胖人群肠道菌群多样性变化特征，招募34位志愿者，依照体重指数（中国标准）将志愿者分为四组，肥胖组、超重组、正常组、偏瘦组。获取志愿者新鲜粪便，提取肠道菌群总DNA。采用Illumina Miseq高通量测序平台，对粪便样本中所有细菌的16S rRNA V4-V5区进行DNA测序，对测序结果进行数据分析。结果发现，超重组的Chao指数显著低于正常组，Shannon指数显著低于偏瘦组，显示超重组的肠道菌群丰富度与多样性最低，正常组的肠道菌群丰富度最高，偏瘦组的肠道菌群多样性最佳;根据主成分分析与柱坐标分析发现，肥胖组的肠道菌群组成与其他三组差异较大，并且肥胖组内各样本距离较远，显示其组成也具有较大差异，提示肥胖人群的肠道微生物菌群构成不止一种模式。

关键词：肥胖;肠道菌群;多样性

中图分类号：Q939.93

文献标识码：A

文章编号"1000-5269（2018）04-0047-07

世界卫生组织（World Health Organization， WHO）最新数据显示，2016年全球成年人超重比例达到39%，肥胖比例高达13%[1]，而中国肥胖人口数量位居世界首位，男性肥胖人数为4320万，女性肥胖人数为4640万[2]。作为一种受遗传因素、环境因素、行为习惯相互作用的复杂疾病，肠道菌群在肥胖发生、发展过程中发挥重要作用。

人体微生物已达到1014个，是人体细胞数目的10倍，而寄存于胃肠道的肠道菌群中，厌氧性细菌占据绝大多数[3]。肠道菌群是一个复杂动态的系统，它处于人体与环境沟通的第一线，它能够与人体互利共生，协同进化，参与宿主能量代谢、免疫应答、生物拮抗等生理活动，由于肠道菌群的代谢能力等同于肝脏，因此，肠道菌群被称为“第二基因组”，又被视作机体的额外器官[4]，在人体与环境的相互作用中起到重要角色。

近年来，针对肠道菌群与肥胖关联的研究显示，肥胖人群肠道菌群在多样性上与正常人群具有差异[5-6]。Tumbaugh等人在对肥胖与非肥胖的双胞胎的研究中发现肥胖患者的肠道菌群总体多样性较正常人群减少[7]，Zupancic等人也有类似的发现，还有研究发现肥胖患者中厚壁菌门与拟杆菌门的比例显著下降[8]，另一项关于学龄前儿童肥胖的研究显示，超重或肥胖的儿童肠道菌群多样性减少，但并没有达到显著性差异[9]。新疆大学对于哈萨克族肥胖儿童的研究显示，肥胖儿童肠道菌群多样性减少[10]。

研究肥胖人群肠道菌群多样性与组成情况，探索肥胖与肠道菌群的关联，能够为研究肥胖发病的机制提供进一步佐证，并为治疗策略的制定和干预后的评估提供参考。

1"材料与方法

1.1"研究对象

1.1.1"来源

所有的研究对象均来自于招募的志愿者，所有志愿者对本实验的内容与性质均有明确认知，并且签署知情同意书，健康信息问卷调查和粪便样本采集均得到本人同意。

1.1.2"纳入与排除标准

纳入本实验的志愿者均为身体健康，无肢体缺陷与精神类疾病;所有志愿者均排除患腹泻、胃肠炎、克罗恩病等肠道疾病、内分泌及代谢性疾病;心、肝、肾等主要脏器无异常;至少一个月内没有使用过广谱抗生素、抗腹泻药物等药物。

1.1.3"样本分组标准

以BMI（Body Mass Index，体质指数=体重（kg）÷身高2（m））中国标准为划分依据，共分为4组，规定BMI数值（kg/m2）分组为：

肥胖组（Group1）≥28

24≤超重组（Group2）lt;28

18.5≤正常组（Group3）lt;24

偏瘦组（Group4）lt;18.5

1.1.4"志愿者基本信息

招募到34位志愿者，依据BMI数值分为4组：肥胖组Group1：4人;超重组Group2：9人;正常组Group3：18人;偏瘦组Group4：3人。

1.2"研究方法

1.2.1"样本采集

事先对所有研究人员进行相关试验培训，严控样本的采集时间与方法。使用采样器采集粪便样本，做好标记冻存于-80 ℃。所有样本在进行后期的检测分析前均保持在-80 ℃冻存。

1.2.2"样本总DNA提取

采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒提取粪便总DNA。

1.2.3"宏基因组16s rDNA扩增

根据 illumina Miseq高通量测序要求，进行双向测序，设计目标区域和带有 “5’Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3’”的融合引物。并采用两步PCR扩增的方法构建文库。

引物序列：

F"5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA

CAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCT

CTTCCGATCT-特异引物-3′

R"5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT

- barcode -GTGACTGGAGTTCCTTGGC

ACCCGAGAATTCCA-特异引物-3′

对于细菌16S V4-V5区，特异引物序列采用：

515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′

926R 5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′

PCR扩增：文库构建采用两步PCR扩增的方法，首先采用特异引物（下面描述为内侧引物）扩增目的片段，将目的片段进行胶回收，而后将回收产物作为模板进行二次PCR扩增（下面描述为外侧引物进行扩增），目的是将 illumina平台测序所需的接头，测序引物，barcode添加到目的片段的两端。根据实验需求，设计引物如下：

F内侧引物：5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特异引物-3′

F外侧引物：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTC-3′

R内侧引物：5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特异引物-3′

R外侧引物：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′

第一次PCR扩增

PCR扩增体系：5xBuffer 10 μL，dNTP （10 mM）1 μL;Phusion超保真DNA聚合酶 1U;F/R内侧引物（10 μM） 各1 μL;模版 5 ng～50 ng;ddH2O 补至50 μL。

PCR扩增程序：1、94 ℃ 2 min;2、94 ℃30 s;3、56 ℃ 30 s;4、72 ℃ 30 s;5、72 ℃ 5 min;6、10 ℃ 保温。2、3、4三步23个循环。

第二次PCR扩增

PCR扩增体系：5xBuffer 8 μL，dNTP （10 mM） 1 μL;Phusion超保真DNA聚合酶 0.8 U;F/R内侧引物（10 "μM） 各1 μL;模版 5 μL;ddH2O 补至40 μL。

PCR扩增程序：1、94 ℃ 2 min;2、94 ℃ 30 s;3、56 ℃ 30 s;4、72 ℃ 30 s;5、72 ℃ 5 min;6、10 ℃ 保温。2、3、4三步8个循环。

1.2.4"肠道微生物菌群宏基因组测序

所有样本采用lllumina MiSeq测序。PCR产物采用Illumina Miseq高通量测序平台进行高通量测序。随后对高质量序列进行提取[11]。

有效序列质控和拼接：（1）采取按窗口去低质量的方法，具体操作如下：50 bp的窗口，窗口内的平均质量值如果低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp 以下的read;（2）根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads 拼接（merge）成一条序列，最小overlap长度为10 bp;（3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列;序列质控采用Trimmomatic软件，拼接采用FLASH软件。

序列优化及统计：为了得到更高质量及更精准的生物信息分析结果，对merge后的reads的质量进行质控过滤。PCR扩增可能产生非特异性扩增，通过特异引物将其去除，序列中可能含有模糊碱基（ambiguous）、单碱基高重复区（homologous）以及PCR过程中产生的一些嵌合体，将这些序列纳入分析范围会降低分析质量，因此去除（screen）此部分序列，可得到精准分析的优化序列，把拼接的长Reads 中的singletons（对应reads只有一条的序列）过滤掉，即最终用于后继聚类OTU的数据，并将OTU注释物种分类结果为非研究对象的序列去掉。在数据去除（screen）时，参数设置：maxambig=0，maxhomop=8，minlength=200，maxlength=580。使用软件：mothur V.1.39.5。

1.3"生物信息学分析

操作单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类分析。利用Usearch算法（Usearch algorithm）所有的序列被归类为OTUs[12]。件平台：Usearch（vsesion 7.1 http：//qiime.org/），将经过上述处理的Clean Tags进行OTU聚类，然后通过对OTU注释完成OTU的物种分类。利用软件USEARCH将拼接好的序列聚类为OTU。

稀疏曲线分析。采用R软件在97%相似性水平绘制样本稀疏曲线，比较测序数量不同的样本物种的丰富度并评估样本的取样大小是否合理[13]。

肠道菌群Alpha多样性分析。根据OTU聚类分析结果进行alpha多样性计算，采用丰度指数（Ace、Chao1）和多样性指数（Simpson、Shannon）分别对样本进行分析，alpha多样性数据进行方差分析[14]。

主成分分析（PCA）。基于OTU的主成分分析 （Principal Component Analysis）是一种对数据进行简化分析的技术。使用97%相似度的OTU进行分析，如样品组成越相似，反映在PCA 图中的距离越近。不同环境间的样品可能表现出分散和聚集的分布情况。

肠道菌群Beta多样性计算。Beta多样性基于UniFrac分析构建距离矩阵，基于距离矩阵进行PCoA（principal co-ordinates analysis）。PCoA是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，PCoA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标，观察个体或群体间的差异。

分析软件：mothur和R语言。

1.4"统计学方法

统计学分析利用R语言（3.0.2）、mothur完成，以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2"结果与分析

2.1"测序结果

对34个样本进行测序后，得到有效序列条数为1379229条，进行优化后，得到的高质量序列为1115415条，平均每个样本32806条。OTU总数目4699，平均值138。

VENN图可用于统计多个样品中所共有和独有的OTU数目，展示的是4组之间的OTU差异情况，交叉的部分指相邻组间共同的OTU，各个数字代表了独有或共有的OTU数。

肥胖组（Group1）数目：292;超重组（Group2）数目：267;正常组（Group3）数目：393;偏瘦组（Group4）数目：226。

肥胖组（Group1）、超重组（Group2）、正常组（Group3）、偏瘦组（Group4）共有OTU数173个。

各组样品独有OTU数目：偏瘦组（Group4）有14个，正常组（Group3）有48个，超重组（Group2）有5个，肥胖组（Group1）有1个。

肥胖组（Group1）与超重组（Group2）共有OTU数目205个，肥胖组（Group1）与正常组（Group3）共有OTU数目276个，肥胖组（Group1）与偏瘦组（Group4）共有OTU数目182个，超重组（Group2）与正常组（Group3）共有OTU数目264个，超重组（Group2）与偏瘦组（Group4）共有OTU数目208个，正常组（Group3）与偏瘦组（Group4）共有OTU数目224个。

肥胖组（Group1）、超重组（Group2）、正常组（Group3）共有OTU 数目203个，肥胖组（Group1）、超重组（Group2）、偏瘦组（Group4）共有OTU数目173个，超重组（Group2）、正常组（Group3）、偏瘦组（Group4）共有OTU数目217个，肥胖组（Group1）、正常组（Group3）、偏瘦组（Group4）共有OTU数目182个。

由图1可知，正常组（Group3）OTU数目与独有OTU数目最多，物种丰富度最高。偏瘦组（Group4）OTU数目与独有OTU数目最少，可能与样本数量有关。

2.2"稀释性曲线

由图2可知，随着测序量的进一步增大，新增OTU的数量逐渐趋于平缓，新数据量产生少量OTU，显示已有数据量合理，可以反映样本中的物种多样性，测序得到的数据可以使用。

2.3"基于OTU的主成分分析

图3显示超重组超重组（Group2）、正常组（Group3）、偏瘦组（Group4）聚集较为明显，肥胖组（Group1）与其它三组距离较远。

2.4"Alpha多样性分析

Chao指数和Ace指数反映样品中群落的丰富度（species richness），肠道微生物菌群的多样性分析采用Shannon指数以及Simpson指数，指数越大，表明样本的多样性越高。

不同组之间，对于Chao指数，正常组（Group3）gt;偏瘦组（Group4）gt;肥胖组（Group1）gt;超重组（Group2），超重组（Group2）与正常组（Group3）之间chao指数差异具有显著性（p=0.0379）;对于Ace指数，正常组（Group3）gt;肥胖组（Group1）gt;偏瘦组（Group4）gt;超重组（Group2）各组之间差异不显著;对于S impson指数，超重组（Group2）gt;正常组（Group3）gt;肥胖组（Group1）gt;偏瘦组（Group4），各组之间差异不显著;对于Shannon指数，偏瘦组（Group4）gt;肥胖组（Group1）gt;正常组（Group3）gt;超重组（Group2），超重组（Group2）与偏瘦组（Group4）之间Shannon指数差异具有显著性（p=0.0368）。

对不同分组间Alpha多样性数据进行方差分析，如图8显示，正常组（Group3）物种丰富度最高，超重组（Group2）最低，综合考虑Simpson指数与Shannon指数，偏瘦组（Group4）的多样性较高，超重组（Group2）多样性最低。

2.5"基于距离矩阵构建的PCoA

由图9可观察到，肥胖组（Group1）与正常组（Group3）、肥胖组（Group1）与偏瘦组（Group4）差异较大，正常组（Group3）与超重组（Group2）有部分重合，菌群组成有一定相似性，正常组（Group3）与偏瘦组（Group4）重合较多，相似性较强。超重组（Group2）与肥胖组（Group1）在图9中有部分重合，显示具有一定相似性。

3"讨论

在其他研究中，多以BMI大小划分为肥胖与正常两个组进行研究[5，15]，但肥胖是一个渐进性过程，更加细致的划分有助于研究不同程度的肥胖与肠道菌群多样性的关联，特别BMI临界阶段的样本数据能带来更多信息。

随着BMI大小上升，肠道菌群多样性与丰富度呈下降趋势。偏瘦组的多样性最佳，与其他研究相吻合[15]，同时国外有研究显示，肥胖人群肠道菌群丰富度低于健康人群[16]。但在肥胖志愿者中，超重组（Group2）人群肠道菌群在丰富度与多样性上均为最低，其肠道菌群丰富度低于肥胖组。肥胖人群会伴随肠道菌群生态失去平衡[17]，而超重组人群处于肥胖的临界阶段，体内的肠道生态由正常状态逐渐向肥胖人群状态转变，未达成新的生态平衡，不利于总体肠道菌群的生长，而肥胖组个体体内的肠道菌群组成达到新的平衡，优势菌群大量繁殖，导致丰富度增加。

PCA与PCoA分析显示，肥胖组（Group1）肠道菌群的组成与其他三组差异较大，其他三组在肠道菌群组成差异较小;肥胖组（Group1）内，不同样本间肠道菌群组成具有明显差异，显示肥胖患者的肠道菌群组成具有不同类型。正常人群的肠道菌群类型可以大致分为三类[18]，而不同肥胖个体的肠道菌群组成也可能会受到遗传基因、饮食、性别等因素影响而产生差异，其组成也存在不同类别。

肥胖人群肠道菌群组成与正常人群具有明显差异，但是限于样本数量与技术手段，对于不同程度肥胖人群与相同肥胖程度个体间的肠道菌群的差异还需进一步研究。

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（责任编辑：江"龙）