基于Gene-Deletor系统的安全复合性状转基因烟草研究

摘 要：本研究利用农杆菌介导法将带有水稻花粉特异启动子籼稻花粉过敏原基因（OSIPA）启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统，水稻OsGA3ox2 （D18）启动子驱动水稻OsGA2ox1基因，玉米Ubiquitin启动子驱动BAR：：GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab 基因复合性状植物表达载体pGM626-D18-Os GA2ox1遗传转化三星烟草。通过GUS组织化学染色及PCR分子鉴定，获得了43株转基因烟草植株。结果表明，水稻OsGA2ox1基因在烟草中表达能降低转基因烟草植株高度，但不影响植株生殖生长。转基因烟草对烟草斜纹夜蛾幼虫具有抗性，可抑制烟草斜纹夜蛾幼虫的取食与发育。以50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片，发现BAR基因提高了烟草抗除草剂的能力。对12株转基因烟草T0代花粉外源基因清除效率进行研究，发现部分烟草株系外源基因清除可达到100%，其他未完全清除外源基因株系的清除效率介于42.84%～99.97% 之间。

关键词：外源基因清除;抗虫;花粉;烟草

中图分类号：Q786

文献标识码：A

文章编号"1000-5269（2018）04-0041-06

赤霉素（gibberellin acid， GA）在植物生长发育过程中起重要调控作用，GA能通过控制植株茎杆的伸长来决定植株高度[1， 2]。植物GA生物合成与信号转导相关基因功能丧失或活性GA分解代谢基因过量表达均可使植物株高降低[2-7]。赤霉素合成代谢中关键酶GA2氧化酶（gibberellin2 oxidase， GA2ox）催化活性赤霉素或赤霉素前体生成无活性的2β-羟基化产物，过量表达植物GA2ox基因可降低植物体内活性GA含量，从而引起植株矮化[4， 8-11]。有研究表明水稻GA3氧化酶基因OsGA3ox2 （D18）启动子仅在水稻茎秆中表达，在生殖器官中不表达，Sakamoto等[8]使用D18 的启动子驱动OsGA2ox1转化水稻，获得了能稳定遗传的株高半矮化、开花及结实正常的转基因水稻植株。利用D18启动子驱动赤霉降解基因EUI同样也获得了株高半矮化而产量不受到影响的转基因水稻植株[1]。

随着基因工程技术的迅速发展，转基因作物商品化规模不断扩大，其安全性问题也日益引起公众的关注。无抗性标记基因转化技术、位点特异性重组酶技术、安全标记基因技术等安全转基因技术已大量用于安全转基因生物的研究当中[12]。其中，外源基因清除（Gene-Deletor）技术，可以通过组织特异或诱导启动子驱动重组酶FLP基因表达，能100 %清除转基因植物中的全部外源基因[13-17]，因此“Gene-Deletor”技术也被认为是目前解决转基因植物环境和转基因食品安全性问题最有效、最具潜力的转基因安全技术之一[12]。本实验室在前期研究中构建了基于“Gene-Deletor”系统带有玉米ZmSDD1基因、除草剂BAR基因及抗虫基因Cry1Ab的复合载体pGM626-DL-Ubi-ZmSDD1-ABt，并遗传转化玉米，获得了能在花粉中100%清除外源基因的抗旱、抗虫、抗除草剂复合性状转基因玉米新种质[18]。

本实验室在前期研究中[11]构建了水稻半矮化抗虫、抗除草剂植物表达载体pGM626-D18-OsGA2ox1，包含D18启动子驱动水稻OsGA2ox1基因，水稻花粉特异性启动子籼稻花粉过敏原基因（indica pollen allergen gene， OSIPA）的启动子驱动的“Gene-Deletor”系统，水稻Actin1启动子驱动Bt蛋白编码基因Cry1Ab，玉米Ubiqutin启动子驱动BAR：：GUS融合基因元件。因此，本研究将pGM626-D18-OsGA2ox1载体遗传转化烟草，验证水稻花粉特异性启动子OSIPA在烟草花粉外源基因清除系统中的作用，同时创制抗虫、抗除草剂、安全的转基因半矮化的烟草新种质，为下一步创制安全复合性状转基因水稻提供技术支持。

1"材料与方法

1.1"材料

植物材料Xanthi烟草（Nicotiana tabacum）为贵州大学山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室收集并保存。植物表达载体pGM626-D18-OsGA2ox1由本实验室设计并构建，带有花粉特异启动子驱动的Gene-Deletor外源基因清除系统、D18启动子驱动OsGA2ox1基因，以BAR：：GUS融合基因为筛选标记基因以及Actin启动子驱动抗虫Cry1A（b）基因（图1）。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404由本实验室保存。

1.2"农杆菌介导法遗传转化烟草及转基因植株鉴定

农杆菌介导的Xanthi烟草遗传转化参考谭颖等[19]方法进行，待无菌苗有大量根生成后，进行炼苗移栽。参考王关林和方宏筠[20]方法，对移栽成活的抗性植株叶片进行GUS组织化学染色，75%乙醇脱色处理后，观察并照相。参照天根植株基因组DNA提取试剂盒说明书方法提取GUS染色呈阳性抗性烟草及野生型植株叶片总DNA。OsGA2ox1基因与10 kDa醇溶蛋白终止序列特异性引物（582 bp）参考郭振等[11]进行设计，BAR：：GUS 基因特异引物（746 bp）：Forward：5’-CCTCGTCCGTCTGCGGGAGCG C-3’，Reverse：5’-GATTATTGACCCACACTTTGCC-3’。PCR产物以1.0%的琼脂糖电泳后进行检测。

1.3"转基因烟草抗虫性鉴定

转基因烟草离体抗虫性鉴定：取相同部位野生型及转基因烟草植株叶片置于同一玻璃器皿中，接种5龄期的烟草斜纹夜蛾 （Spodoptera litura （F.））幼虫于叶片上，每皿接种虫数为15头，重复3次，3 d后观察烟草叶片受损程度。整株植株抗虫性鉴定：将每一独立转基因烟草株系作为一个样本，每个样本接种5龄期斜纹夜蛾幼虫15头，重复3次，2周后观察统计斜纹夜蛾虫幼虫虫体形态。

1.4"转基因烟草离体叶片除草剂抗性鉴定

选用浓度为10% （w/v）Basta商品原液（BIO BASIC INC.产品），蒸馏水稀释至浓度为50 mg/L备用。选取野生型与转基因植株中大小及生理状态一致的叶片，将野生型和转基因烟草叶片共同置于浸泡有浓度为50 mg/L的Basta溶液滤纸上，保持滤纸湿度，16000lux光照强度（光照16 h/黑暗8 h），7 d后观察叶片状态并拍照。

1.5"转基因烟草花粉外源基因清除

随机选取12株GUS检测及PCR检测呈阳性的转基因烟草植株，参考Luo等[17]方法在烟草开花12期对T0代转基因植株花粉进行GUS染色，徕卡显微镜下对花粉粒进行观察并统计视野内花粉粒GUS染色情况，计算外源基因清除效率。外源基因清除率（%）= （花粉粒总数-GUS染色阳性花粉粒数）/花粉粒总数×100%。

1.6"数据分析

以Excel 2013软件及SPASS18.0统计软件进行数据处理、统计与差异性分析。

2"结果与分析

2.1"农杆菌介导烟草遗传转化及转基因植株获得

采用农杆菌介导法遗传转化Xanthi烟草，以除草剂作为筛选剂进行抗性筛选，将获得的抗性芽生根培养后进行炼苗移栽。对抗性植株进GUS组织化学染色，提取GUS检测呈阳性的植株叶片DNA，对转基因植株中GUS基因与OsGA2ox1基因进行PCR分子检测，获得43个PCR检测呈阳性独立转基因烟草植株（图1）。

2.2"转基因烟草植株表型

对转基因植株生长进行观察发现，转基因株系整个生育期均表现为生长比野生型慢，到成熟期时，转基因烟草植株株高半矮化，但叶片与野生型相同部位叶片在形态与大小上没有差异，且开花与结籽均与野生型烟草同步进行（图3）。成熟后的转基因烟草种子也可正常萌发，未出现不育现象（结果未列出）。分析原因可能是由于OsGA2ox1基因仅在烟草茎秆中表达，仅影响烟草赤霉素代谢调控降低株高，不影响叶片及花发育，说明水稻D18启动子驱动OsGA2ox1基因的表达只是调节了植株株高而不影响生殖生长。

2.3"转基因烟草抗虫性鉴定

转基因烟草与野生型叶片离体混合喂食烟草斜纹夜蛾幼虫3 d后，发现斜纹夜蛾幼虫更倾向于取食非转基因的烟草叶片，转基因烟草叶片相对于野生型来说受损程度小（图4 A）。对整株饲养2周后的斜纹夜蛾幼虫研究发现，饲养转基因烟草的斜纹夜蛾虫体长为饲养野生型斜纹夜蛾虫69.85%，体重仅为其 36.59%（图4 B-D）。表明Cry1Ab蛋白可以抑制幼虫的取食，同时还影响其生长发育，说明转CrylAb基因烟草对斜纹夜蛾具有抑制效果。

2.4"转基因烟草除草剂抗性分析

以浓度为50 mg/L的除草剂Basta处理野生型和转基因烟草离体叶片，研究转基因烟草对除草剂抗性发现，野生型叶片处理3 d后从叶脉开始褐化，7 d后野生型叶片所有叶脉褐化，并伴随大部叶片褐化，而转基因叶片则在处理7 d后叶脉开始褪绿，叶片仍保持绿色，这说明转BAR基因提高了转基因烟草抗除草剂的能力。

2.5"转基因烟草花粉外源基因删除效率

水稻花粉特异性启动子OSIPA驱动重组酶FLP基因表达，可在成熟花粉中清除外源基因。在烟草花粉发育12时期，随机挑选12株转基因植株，对其花粉进行GUS组织活性染色。结果表明，12株转基因烟草花粉的清除效率有差异，其中转基因5#与9# 株系花粉中未检测到蓝色信号，统计显示外源基因清除达到100%。其他株系花粉有部分呈蓝色，说明株系花粉中外源基因未完全清除，统计结果显示外源基因清除效率介于42.84%～99.97%之间（图6，表1）。

3"讨论

赤霉素2氧化酶（GA2oxs）是多基因编码的双加氧酶，通过2β羟基化作用钝化内源有生物活性的赤霉素（GAs）来调节植物的生长[7， 9， 10]。GA2oxs基因表达上调可引起有生物活性的GA 含量降低，从而使植株矮化[4]。以组成型启动子Actin1驱动OsGA2ox1基因会引起转基因植株的极度矮化，且产量也受到影响[4]。水稻D18启动子只在水稻茎秆中表达，在生殖器官中不表达，不会影响植株的生殖生长[21]。以D18启动子驱动水稻赤霉素代谢基因OsGA2ox1和OsEUI遗传转化水稻，均获得了株高半矮化且产量不受影响的转基因水稻植株[1， 8]。本研究利用水稻D18启动子驱动水稻OsGA2ox1基因遗传转化烟草，同样也获得了开花与结实正常，株高半矮化的烟草转基因植株，说明水稻D18启动子在双子叶烟草中也仅在茎杆中表达，而不在生殖器官中表达。

刘臣等[22]研究4种Bt蛋白对鳞翅目害虫的杀虫活性发现，Cry2Ah1对斜纹夜蛾杀虫活性最强。Tiwari等[23]利用合成的cry1EC基因提高了转基因花生对斜纹夜蛾的抗性。本实验室前期利用人工合成修饰改造的Cry1Ab基因遗传转化玉米，提高了转基因玉米对玉米螟的抗性[18]。本研究中Cry1Ab基因表达同样也提高了转基因烟草对斜纹夜蛾幼虫抗性，表明经人工合成修饰改造的Cry1Ab基因不会影响其抗虫性。除草剂抗性是目前杂草防治中有效的重要农艺性状，BAR基因在基因工程中不仅可以作为筛选基因使用，也可作为目的基因使用[24]。本研究中BAR基因表达也提高了转基因烟草对除草剂的抗性。

利用玉米ZM13花粉启动子驱动Gene-Deletor系统来清除花粉中的外源基因已在烟草、玉米中获得了成功[17， 18]。研究发现，OSIPA启动子在单子叶植物水稻与双子叶植物拟南芥的花粉中均可特异表达，对不同片段长度OSIPA启动子启动效率进行研究发现，1640 bp片段长度的启动子序列的启动效果最强[25， 26]。利用OSIPA启动子驱动Gene-Deletor系统清除转基因烟草花粉中外源基因，有两株转基因株系可以获得100%删除效率，而其他转基因株系中外源基因未被完全清除。由于OSIPA启动子为花粉特异表达，外源基因将在每一代转基因烟草的花粉中自动清除，花粉的外源基因最终将被完全清除。

4"结论

本研究利用带有水稻OsGA3ox2 （D18）启动子驱动水稻OsGA2ox1基因，玉米Ubiqutin启动子驱动BAR：：GUS融合基因为筛选标记基因以及水稻Actin1启动子驱动驱动抗虫Cry1Ab 基因复合性状植物表达载体pGM626-D18-Os GA2ox1遗传转化烟草，获得了目的基因均能正常表达的半矮化、抗虫、抗除草剂的复合性状及花粉特异清除外源基因的转基因烟草植株。本研究扩展了外源基因清除系统的启动子范围，为复合性状的安全转基因植物新种质培育及下一步外源基因清除系统在水稻中利用提供了技术支持。

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（责任编辑：江"龙）