抗菌药物敏感性快速检测方法研究进展

何渊慧(HE Yuan-hui)，奕巧莲(YI Qiao-lian),杜文斌(DU Wen-bin),郑 波(ZHENG Bo)

(1 北京大学第一医院 临床药理研究所，北京 100034； 2 中国科学院微生物研究所 微生物资源前期开发国家重点实验室，北京 100101； 3 中国科学院大学，北京 100049)

抗菌药物的发现是二十世纪巨大的医学成就。抗菌药物的使用大大降低了传染疾病的病死率，挽救了无数生命，也使以前的一些绝症，如结核病都有了治疗的方法。然而最近六十年，我们开始从抗菌药物的辉煌时代走向抗菌药物耐药性时代[1]。2014年世界卫生组织发布了全球耐药报告[2]，指出抗菌药物耐药细菌正蔓延至全球各地。

细菌耐药严重威胁着人类健康，尤其是对于严重感染的患者，急需敏感度、特异度更高和更快速的检测方法，快速确定是哪种细菌感染，并分离病原微生物进行抗菌药物敏感试验(antimicrobial susceptibility testing，AST)，以指导临床选择抗菌药物和相应剂量。传统检测药敏值的方法有肉汤稀释法(包括微量肉汤稀释法与宏量肉汤稀释法)、琼脂稀释法、E-test法及纸片扩散法等。宏量肉汤稀释法过程繁琐，在不同浓度抗菌药物溶液制备过程中易出差错；微量肉汤稀释法的主要缺点在标准化的商业平板中检测的药物种类较固定，药物浓度梯度少，在抗菌药物折点更新后可能无法覆盖折点；E-test方法缺点是抗菌药物品种有限，成本较高，且在检测联合药敏时，由于系统误差，MIC值会较高或较低[3]；此外，传统方法检测获得药敏结果常所需时间较长，易导致漏诊、误诊和延误治疗[4-5]。因此，寻求新的快速、准确的病原菌耐药检测技术是实现临床耐药细菌感染快速和有效治疗的核心，也是突破当前抗菌药物滥用困境的关键。一些新型的药敏检测方法在不断涌现。本综述将近期基于分子生物学和适用于现场快速诊断的微型化、便携化抗菌药物敏感性快速检测方法的研究进展作系统阐述。

1 自动化检测仪器

微生物自动鉴定及药敏测试系统结合微量快速培养基和微量生化反应系统，实现了药敏检测的自动化和机械化，使得原来缓慢、繁琐的手工操作变得快速、简单。典型的产品有法国生物梅里埃公司(BioMérieux)VITEK 2 德灵公司(MicroScan)的Walk Away SI以及BD的PHOENIX等。不同自动化仪器价格昂贵，通常依赖数据库的更新与补足，方便有余，灵活不足。见表1。

表1 市面常见的微生物自动鉴定及药敏测试系统

2 基于分子生物学的药敏检测方法

2.1 以实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative PCR, qPCR)为基础的检测方法 qPCR是指在PCR 反应体系中加入荧光基团(染料或探针)，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[6]。qPCR应用于AST，主要通过对扩增目的基因的定量检测，反映不同药物浓度下细菌的生长情况，以实现快速检测。

目的基因的恰当选择对检测技术的灵敏度至关重要，并在一定程度上影响实验结果[7]。Harris等[8]同时扩增pbp2b与lytA基因，快速诊断肺炎链球菌感染，发现其检测细菌灵敏性高于同研究中以管家基因16S rRNA为目的基因的qPCR的100倍以上；pbp2b的检测结果反映肺炎链球菌对青霉素的药敏。Peuchant等[9]以沙眼衣原体功能不同的omp1、omp2、16S rRNA，以及Hsp60编码基因groEL1 四种基因作为目的基因监测菌体的生长，最终选择灵敏度高特异性好的omp1作为目的基因，检测沙眼衣原体对氧氟沙星、莫西沙星、阿奇霉素、多西环素的药敏。

在不同的耐药性检测中，相同细菌选择的目的基因以管家基因16S rRNA居多[7, 10-13]，但也有选择其他作为目的基因者，如结核分枝杆菌以特有基因rpoB作为目的基因[13]。检测不同药物对幽门螺杆菌的药敏时，以23S rRNA、gyrA为目的基因[12, 14]，有研究先用管家基因16S rRNA鉴定细菌种属， 再以23S rRNA为目的基因检测幽门螺杆菌对克拉霉素的药敏[12]。与检测耐药基因反映细菌的耐药性不同，Kearns等以青霉素敏感基因pbp2b作为目的基因，反映肺炎链球菌对青霉素的AST[15]。

2.2 分子生物学法定义最低抑菌浓度(MIC)以及检测MIC的最佳时间点 不同的研究对MIC的定义不同，检测MIC的最佳时间也不同。处于发展阶段的分子生物学检测技术目前无统一指南，需研究者继续探索。

Hamasuna等[16]每周一次体外试验检测尿道支原体，连续4周监测其生长，MIC定义为引起99%抑制率的最低药物浓度，抑制率 (%) = [(质控组中DNA量 -测试组中DNA量)/ 质控管组中DNA量]×100%。由于第四周与第三周的MIC值相同，最终选择第三周作为检测MIC值的最佳时间点；Aloni-Grinstein等[17]检测细菌1次/h，连续48 h 监测细菌在不同浓度药物下的生长，最终选择细菌与药物混合培养的24 h作为MIC值检测的最佳时间，MIC 定义为无肉眼可见的细菌，且能降低细菌浓度至低于质控菌OD630的10%时的最低药物浓度。Peuchant等[9]在细菌与药物共同培养后的0、3、 6、12、16、 21、25、29、 36、45和53 h分别进行检测，由于检测细菌的4种基因在30 h后均处于静止状态，因此，以30 h作为读取MIC值的最佳时间点，MIC定义为与最初细菌DNA 浓度有相同值的最低药物浓度。

2.3 反转录PCR法 用反转录PCR检测细菌的耐药性[18]，相比于以提取的DNA直接作为反应模板的荧光定量PCR法，反转录PCR花费时间长，检测成本高。Peuchant等[9]用反转录PCR对mRNA进行定量检测，验证研究中目的基因是否转录，将MIC定义为能抑制基因转录的最低药物浓度qPCR法能快速准确获取药敏结果，但需更多样本进行验证； 部分PCR或以PCR为基础的分子生物学方法通过检测耐药基因反映细菌药敏有一定的局限性，毕竟与细菌表型耐药有关又确定的基因有限，而细菌对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类等抗菌药物的耐药又涉及成百上千的基因突变与多种耐药机制的表达，难以通过简单的基因检测确定。

3 基于微流控芯片的药敏检测新方法

微流控芯片将生化领域中的样品前处理、检测等操作，经由微纳米通道集成到一块厘米级别的芯片上应用于临床诊断，相对传统方法更快、更灵敏。在药敏检测领域，利用微流控检测细菌耐药性主要有单细胞检测，以及与药敏相关的生化物质检测。见表2。

表2 基于微流控芯片的药敏检测方法

3.1 基于药敏相关的生化物质检测药敏 耐药菌与敏感菌在抗菌药物作用下会表现出不同的生化指标，利用这些指标的不同可区分耐药菌与敏感菌。Besant等[19]利用活细胞和死细胞指示剂的氧化还原反应检测细菌的代谢活动，并通过电化学信号读取表征细菌的耐药情况，减少了预培养富集的环节，1 h内即可获得耐药表型结果。Mach等[20]将泌尿道感染采集的尿样品直接与含抗菌药物培养基培养2.5 h后，利用电化学定量检测细菌16S rRNA水平可得到细菌耐药表型，从收集尿样本到获得检测结果仅需3.5 h。Burckhardt等[21]直接利用MALDI-TOF鉴定菌种并检测NDM-1、VIM-1、VIM-2、KPC-2和不同种类的IMP酶获得细菌对碳青霉烯类药物的耐药情况，较之传统的利用光密度检测方法，质谱检测更精准并快捷，在1～2.5 h内即可获得检测结果。MALTI-TOF还不能检测所有与耐药相关的蛋白，以上这些方法依赖复杂的仪器，芯片的制作复杂，不利于推广。

3.2 微流控 pH 感应器检测法 监测代谢产物可应用于细菌的功能测定[22-23]。在细菌培养过程中，生长培养基由于葡萄糖或糖代谢产物有机酸的积累变得酸化，监测培养基pH值的变化已成为细菌功能分析常用方法之一。抗菌药物可抑制细菌的生长，降低葡萄糖代谢率。检测固定在纳升孔道中快速积累的细菌代谢产物，避免了耗时的预孵育，从而减少检测时间。有效光学厚度[24]作为光学信号，可反映由pH值变化引起的壳聚糖水凝胶的溶胀，通过监测EOT增加率，确定抗菌药物对细菌的抑制作用。

实验中，每20 min检测了一次，监测时长约3 h。依据抑制率定义抗菌活性，抑制率的公式：I =(△EOTblank-△EOTantibiotic)/△EOTblank；公式中△EOTblank和△EOTantibiotic分别代表在该时期无抗菌药物样本和有抗菌药物样本EOT的变化。

基于抑制率的MIC检测方法尚未确定，不同时期检测的MIC值大不相同，检测MIC值的最佳时间仍在探索中，但最多需要2 h。反应中菌液最初浓度与微量肉汤稀释法的最初浓度5×105CFU/mL一致，而药物的浓度范围为包括由美国临床实验室标准化协会(CLSI)指南推荐的用于临床分离菌中检测MIC抗菌药物浓度内的连续5个2倍稀释梯度浓度[25]。

微流控pH感应器检测法获得AST检测结果所需时间短，能在细菌的代谢水平上检测细菌的药敏值，培养时间不同，MIC值明显不同，对MIC值检测的最佳时间的确定将是该研究的另一探索。

3.3 微流控检测细胞膜机械压力 机械压力和酶的联合作用破坏细菌的生物膜，药物能干扰敏感菌修复生物膜系统，却不能干扰耐药菌，荧光标记的生物膜以呈现的颜色不同被分为活细菌与死细菌，利用该装置收集的不同荧光信号，以细菌死亡的速度确定细菌的表型(易感与抗性)，反映细菌的药敏，分别用甲氧西林耐药、敏感的质控菌作为模型，建立检测体系后，用16株临床分离金黄色葡萄球菌进行验证。

研究中每2 min检测一次，连续监测60 min，该监测提供了定量信息，不需MIC检测，即可提供一个客观的药敏评价标准。由于药液菌液混合培养60 min为细菌死亡率最高的时期，该研究以此作为AST检测的最佳时间点。经验性的以模型细菌死亡率的0.5%、1%分别作为敏感与中介、中介与耐药的分界点，以此建立敏感、中介、耐药的检测标准，对细菌的耐药敏感与否进行定性分析。同时对苯唑西林10、50 mg/L检测浓度进行摸索，由于50 mg/L的检测结果更接近以纸片扩散法作为对照方法的检测结果，被选择作为细菌耐药性的检测浓度[26]。该方法从表型分析细菌耐药性，快速获得AST检测结果。研究着重于机械力和酶的破坏力[27-28]，经验性建立的耐药、中介、敏感的分界标准，也需进一步验证，且不能检测细菌对抑菌剂的药敏状况。

3.4 单细胞检测药敏 单细胞检测可有效避免传统方法中生长富集的过程。Liu等[29]将待检菌与含有抗菌药物的培养基一起包裹在皮升级液滴中共培养，利用耐药菌增殖改变光学性质，从而筛选出耐药菌得到药敏结果，但该方法存在的问题是每次只能进行一种条件的筛选。Choi等[30]在显微镜下追踪单细菌在抗菌药物作用下发生的形态变化，通过研究细菌的分裂行为，得到细菌的耐药表型，高分辨显微识别分析图像需要相应的仪器支持，限制了其检测通量。Baltekin等采用微流控芯片捕获临床分离样本中的细菌，用显微镜观察多个单细菌在不同浓度下的生物反应状况，30 min即可获得细菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、美西林、多利培南、环丙沙星、左氧氟沙星、磷霉素、呋喃妥因、磺胺等临床治疗泌尿系感染常用的9种药物的药敏结果[31]，但该研究检测对象只有大肠埃希菌，并未涉及肠球菌属细菌等其他种类细菌。Longo等[32]提出了一种基于原子力显微镜的检测方法，在该方法中，悬臂可以在细菌低浓度的情况下表征细菌的代谢活动，通过检测细胞膜的变化，在十分钟内读取细菌对抗菌药物的敏感性，该方法只能得到粗略的耐药结果，且所需仪器操作要求高，不利于推广。

基于单细胞的药敏检测虽然缩短了单次检测时间，但增加了检测总量，实际并没有提高检测效率。

4 其他快速药敏检测方法

4.1 Micromax 试剂盒 原理：研究者利用Micromax 试剂盒，检测细菌在含不同浓度药物的培养基中生长时DNA的状况，判断细菌对药物的敏感、中介及耐药情况。依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)指南，Bou等[33]选择细菌敏感、中介、耐药等4个药物折点浓度，将试验菌株分别与不同浓度的药物在培养基中共同培养60 min，并对试验细菌的DNA进行染色。细菌在CLSI定义为敏感浓度的药物中孵育60 min，DNA出现扩散的现象，则该细菌对该药物敏感；细菌在CLSI定义为中介浓度的药物中孵育60 min，DNA才出现扩散的现象，则该细菌对该药物为中介；细菌在CLSI定义为耐药浓度的药物中保持完整或者在比耐药浓度更高浓度的药物中孵育60 min后DNA才出现扩散的现象，则该细菌对该药物耐药。

Bou等先用该方法分别检测标准菌株对美罗培南、环丙沙星的药敏情况，再用322株临床分离菌株进一步验证，以微量肉汤稀释法和E-test法的检测结果作为对照，新方法60 min即可获得与对照方法完全一致的检测结果。虽然在检测过程中，检测背景里会出现多余的DNA片段，但由于检测背景可变，这些片段的量较少，而且只是在与抗菌药物共同孵育前的培养基中出现，并不会影响检测结果的判断[33]。

该方法准确快速获取定性药敏检测结果，未涉及细菌对抑菌剂的药敏检测，但还需要更多种类的抗菌药物和更多种类的细菌进一步验证。

4.2 SERS-AST 法 该技术监测细菌的活性，赋予其光谱特异性。当细菌与不同浓度药物混合后，由细菌表面特异性标志物减少引起的拉曼散射(surface-enhanced Raman spectroscopic，SERS)光谱强度2 h内下降，依据下降的比例反映细菌的AST结果。

研究者分别在细菌与药物混合后培养的0、1、2、4、6 h进行检测，并监测细菌的生长，取2 h作为检测MIC值的最佳检测时间，革兰阳性菌：r730 < 0.5；革兰阴性菌：r654<0.5 或 r724<0.5(r730/r654/r724为分别在730/cm、654/cm、724/cm处拉曼散射峰的信号率)，作为判断抗菌药物发挥活性的标准。MIC值检测时间点定为混合培养后2 h，这是综合药物治疗效果之后的经验性选择。药物浓度设置为包含标准浓度在内的由低至高的4个浓度，并探索性的设置最初检测细菌浓度为1×106、1×107、1×108CFU/mL三个等次，最终选择与微量肉汤稀释法药敏结果最接近的1×106CFU/mL作为检测细菌的最初浓度[29]。

SERS-AST 法所得AST检测结果与微量肉汤稀释法结果基本一致，传统方法需过夜培养，而该方法只需菌液与药物共同培养2 h。研究者经验性的选择革兰阳性菌r730 < 0.5，革兰阴性菌r654 < 0.5 或者 r724 < 0.5作为有抗菌活性的评判标准，仍需进一步验证；值得一提的是该仪器的最低检测限度为1×105CFU/mL，在一定程度上限制了MIC值的检测；SERS-AST 法检测成本亦不容忽视；另外，其只检测了细菌对苯唑西林与亚胺培南的药敏，对于抑菌剂等其他种类的药物需要更多验证。

5 总结

多种检测技术的兴起为临床提供快速的AST检测结果，qPCR法3 h即可获得结果[17]，敏感度高，污染低，操作容易且结果准确[34]，其他方法检测时间更短[26,29,33]，能够获得传统药敏检测方法难以得到的药敏值，特别适用于传统培养皿中不能生长或生长缓慢的病原微生物[16]，为治疗效果提供重要信息[8]，使患者从昂贵的广谱抗菌药物转向更精准实惠的药物治疗，有利于减少耐药细菌的产生。

mRNA 水平的基因表达分析结果仅能提示蛋白水平或功能学的改变，而非确证[35]。目前，仅有限的证据说明突变类型和抗菌药物耐药性水平有关，但不可能十分准确地从分子水平预测其耐药水平[36]。而SERS-AST 法通过监测细菌表面特异性标志物的光谱强度在不同药物浓度中下降的比例，反映细菌的AST结果；微流控pH感应器检测法通过监测细菌在不同浓度药物中代谢产物引起培养基pH值的变化，获得AST结果；微流控平台检测法利用耐药或者敏感细菌能否在药物干扰下修复生物膜系统，反映细菌的耐药与否。

依据细菌谱进行传统法培养对监测细菌生长意义重大，研究者在实验设计中应根据自己的研究目的选择最适宜的检测方法[7]。Lehours等[37]建议,实验者在标准微生物培养失败后，方考虑分子生物学方法。

庆大霉素处于高浓度方有抑菌作用[38]，药物处理至少32 h后才有对抗胞内生长菌作用[17]，处理5 d 后才完全发挥作用[39]。由此看来，检测慢性细胞膜渗透药物对微生物的药敏时，分子生物学检测技术尚待考虑。

上述研究均有不足，大多强调需要更大样本量的验证，并未提及检测成本[29, 40-41]。AST检测新技术仍在发展中，并未取代传统方法[29]，检测成本是qPCR检测技术广泛应用于临床细菌AST检测的主要障碍[16]。

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