昆明地区汉族人群FAS/FASL基因多态性与糖尿病视网膜病变的相关性分析

张 娴，李园园，李雪江，张 燕，胡廷华，马俊彦

昆明地区汉族人群FAS/FASL基因多态性与糖尿病视网膜病变的相关性分析

张 娴1，李园园1，李雪江1，张 燕1，胡廷华2，马俊彦2

目的探讨Fas-1377G>A和FasL-844C>T基因多态性与昆明地区糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的相关性。方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)技术对31例DR患者(病例组)和23例糖耐量正常的对照者(对照组)进行FAS-1377、FASL-844两个基因多态性检测基因型及等位基因频数分布。结果fas-1377位点3种基因型AA、AG和GG在对照组研究对象中的频数分别为9.7%、54.8%和35.5%，在病例组的频数分别为13%、52.2%和34.8%，基因型频数分布组间比较差异无统计学意义(fisher=0.282,P=1.0)；等位基因A和G在对照组中的频数分别为37.1%和62.9%，在病例组的频数分别为39.1%和60.9%，等位基因型频数分布组间比较差异无统计学意义(χ2=0.046,P=0.829)。fasL-844位点3种基因型CC、CT和TT在对照组研究对象中的频数分别为41.9%、45.2%和12.9%，在病例组的频数分别为60.9%、34.8%和4.3%，基因型频数分布组间比较差异无统计学意义(fisher=2.178,P=0.334)；等位基因C和T在对照组中的频数分别为64.5%和35.5%，在病例组的频数分别为78.3%和21.7%，等位基因型频数分布组间比较差异无统计学意义(χ2=2.393,P=0.122)。用logistic回归分析4种模型， FasL-844基因携带T者患病例组风险可能升高，TC,TT,TC+TT,TOR值分别为1.885，4.308，2.154，1.980(P>0.05)，无统计学意义。同时携带FAS-1377GG和FASL-844 CT/TT基因型的风险较同时携带FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患DR发病风险(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261)；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，差异均无统计学意义。结论Fas-1377、FasL-844基因多态性位点可能与昆明汉族DR易感性无相关性，可能不是该地区DR的常见遗传易感因素。

糖尿病视网膜病变；Fas-1377；FasL-844；基因多态性

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是最常见造成视力减退或失明的眼病，流行病学研究表明，5年以上的糖尿病患者约51.3%发生视网膜病变[1]，严重者可导致失明，其致病性尚未完全阐明，目前认为多种因素，包括遗传、环境因素及其相互作用与该病的发生密切相关，随着DR遗传学研究的发展，基因多态性与DR的关系倍受关注。现有报道DR有关的染色体突变位点已达20余个，其中FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因多态性与DR的关系己在白种人中得到证实[2]，但在不同国家及地区人群中患病率是否存在差异尚未报道。笔者通过PCR-RFLP，并结合DNA测序来探讨该基因组多态性在中国云南昆明地区2型糖尿病视网膜病变人群中的相关性，为今后FAS/FASL基因多态性在2型糖尿病患者视网膜病变的病因研究及群体筛查奠定基础。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2012-11至2015-12在武警云南总队医院就诊的2型糖尿病患者82例，经眼底镜和(或)眼底荧光造影检查确诊DR者病例组31例(DR组)，其中男17例，女14例，年龄(57.89±13.42)岁，糖尿病病程8.5～36 (23.11±3.3)年；在我院体检的正常对照组(NC组)23例，男11例，女12例，年龄(55.63±4.17)岁。检测者均来自云南省昆明地区居住的汉族人群，记录2组的性别、年龄、身高、体重均无统计学差异。

1.2 实验步骤

1.2.1 DNA提取 取外周静脉血5ml，蛋白酶K处理后苯酚氯仿法提取基因组DNA。

1.2.2 DNA引物 见表1。

表1 FAS/FASL DNA 引物序列

1.2.3 PCR反应体系(20 μl体系)及反应条件 PCR反应体系为20 μl，包括10×Buffer(Mg2+Plus)2 μl，Taq酶(5 U/μl)及dNTP(10 mM)各0.2 μl，上下游引物各0.4 μl ( 20 pmol /μl) ，DNA模板1 μl ( 50～300 ng /μl) ，不足部分由双蒸水补充。FAS-1377位点PCR扩增参数: 预变性95 ℃，5 min，变性94 ℃，30 s，退火FAS63 ℃，FASL68 ℃,30 s，延伸72 ℃，30 s，变性、退火、延伸40个循环后，再次延伸72 ℃，7 min。FASL-844位点PCR扩增参数: 预变性95 ℃，5 min，变性94 ℃，30 s，退火68 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s，变性、退火、延伸40个循环后，最后72 ℃延伸7 min。

1.2.4 酶切反应体系 取5 μl PCR产物加0.5 μl限制性内切酶Apal(Fermentas公司)双蒸水补足至10μl，恒温箱37 ℃水浴过夜。

1.2.5 DNA测序 酶切产物在4%的琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，纯化产物双向测序，采用测序仪器3730XL (BigDye Version3.1,Applied Biosystems)，用Sanger双脱氧链终止法进行DNA测序，观察结果。

1.3 统计学处理 采用spss16.0软件对数据进行处理，两组间比较采用t检验及协方差分析；应用fisher确切概率法进行基因型分布的Hardy-Weinberg平衡性检验，病例组与对照组间基因型与等位基因型分析的Fisher检验、logistic回归分析，并对成组资料进行相关分析；对计数资料进行χ2检验和非条件logical回归分析FAS/FASL基因多态性与疾病的相关性。以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DNA测序 PCR扩增产物FAS长度为284 bp FASL长度为401 bp，且条带清晰，可用于后续酶切反应(图1、2)。

2.2 两组SNP基因型和等位基因分布 基因型和等位基因频数分布在对照组和病例组研究对象中分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=1.061，P=0.588；χ2=0.028，P=0.986)，具有群体代表性。

图1 FAS基因-1377C>T位点PCR产物电泳图

M：代表50bp递增的DNA标记物(Marker)，1、2、3、4、5、6、7、8 代表G/A 基因型只有284 bp 一条片段

图2 FASL基因-844C>T位基因型PCR产物电泳图

M：代表50bp递增的DNA 标记物(Marker)，1、2、3、4、5、6、7、8 代表C/T基因型只有401 bp一条片段

病例组和对照组研究对象基因型、等位基因频数分布组间比较差异均无统计学意义(fisher=0.282,P=1.0)、(χ2=0.046,P=0.829)、(fisher=2.178,P=0.334)、(χ2=2.393,P=0.122)。详见表2，表3。

表2 两组患者FAS-1377 G/A SNP基因型和等位基因分布 (n；%)

注：P>0.05，在病例组合对照组中无统计学意义。①表示有两个单元格的理论频数<5,采用fisher确切概率值

表3 两组患者FASL-844 C/T SNP基因型和等位基因分布 (n；%)

注：P>0.05，在病例组合对照组中无统计学意义。①表示有两个单元格的理论频数<5,采用fisher确切概率值

2.3 用logistic回归分析4种模型， FasL-844基因携带T者患PDR风险可能升高，TC,TT,TC+TT,T，OR值分别为1.885，4.308，2.154，1.980，P>0.05，无统计学意义(表4，表5)。

表4 病例组和对照组间FAS-1377G/A SNP的基因型及等位基因分布 (n；%)

表5 病例组和对照组间FASL-844C/T SNP的基因型及等位基因分布 (n；%)

2.4 同时携带FAS-1377GG和FASL-844CT/TT基因型的风险较同时携带FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患增殖期2型糖尿病视网膜病变发病风险(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261))；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，P均>0.05,无统计学意义(表6)。

表6 糖尿病视网膜病变病例组和对照组间FAS-1377&FASL-844的基因型及等位基因分布 (n；%)

3 讨 论

近年来，DR致病基因多态性的研究不断深入，现已筛选出与发病相关联的基因有数十种，如白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)基因、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)基因、血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)基因等，这些基因在参与DR的发生与发展过程中有不同程度的相关性[3]。如此多的基因多态性与DR的发生发展相关联，说明DR(DR不分1型和2型)是发病机制众多、由多种因素参与并与遗传相关的一组基因多态性疾病[4]。

Fas基因(10q24.1，又名CD9/APO-1),属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族[5]。是含有325个氨基酸的膜蛋白。Fas基因为FasL基因的受体，FasL是以三聚体的形式存在,必须有3个Fas受体与1个FasL结合,通过Fas胞内的死亡结构域与FADD(fas-associated protein with death domain)梭基端的死亡结构域相互连接,募集细胞中的FADD,同时与Caspase-8酶原中的死亡效应结构域相互作用,形成死亡诱导信号复合体(death-inducing signing complex,DISC)[6]，启动凋亡程序,激活下游分子链,降解细胞蛋白质、骨架和核酸等,目前认为这可能是糖尿病视网膜毛细血管周细胞调亡的重要执行途经[7]。FAS/FASL基因变异型增加DR的患病风险的原因是[8]：Fas/FasL基因启动子区的单核苷酸多态(SNPs)破坏了Fas基因低表达，出现Fas基因的高表达，因此FAS/FASL的结合启动了视网膜周细胞凋亡[9]。

本文提示 FasL-844基因携带T者患DR风险可能升高，TC,TT,TC+TT,TOR值分别为1.885，4.308，2.154，1.980，P>0.05，无统计学意义。携带FAS-1377GG和FASL-844 CT/TT基因型的较同时携带FAS-1377GG和FASL-844CC基因型增加患糖尿病视网膜病变发病风险(OR=1.143(95%CI=0.141-9.289)；OR=0.343(95%CI=0.052-2.261)；OR=2.286(95%CI=0.185-28.186)，P均>0.05,无统计学意义。本实验在病例组及对照组中未发现与FAS/FASL基因的相关性，由此说明该位点相关性确实很低。初步认为存在以下问题：首先本组分析筛查样本量较少，FAS/FASL基因多态性启动的细胞凋亡与DR的关系有待进一步验证。其次FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因存在多态异质性，如视网膜母细胞瘤与该位点的相关性已确认，但房水、视网膜检测的相关性是否存在差异并未得到验证，而静脉血检测与该位点的相关性较低；再次Itoh N等对不同人种DR的基因SNPs位点与之发生的相关性进行了研究[10]：认为FAS/FASL基因自身存在高度遗传异质性，在不同地区和不同种族人群的遗传环境差异性导致不同组织，不同生活习惯、不同背景因素等方面差异较大[11]，甚至在亚洲人群中也不尽相同，如AR基因(-106CC)基因型可能是美国及巴西2型糖尿病患者的易感基因[12]；在印度某地区2型糖尿病与VEGF基因启动区,5′-UTR的基因多态性是DR的主要危险因素[13]，677C-T等位基因可能是日本患者的DR易感基因[14]，说明同一基因在不同区域的致病性并不相同，或同一区域、不同民族对同一基因的易感性也不一样。

本文结果提示FAS-1377G>A/FASL-844C>T基因多态性可能不是中国云南昆明地区DR患者的常见易感基因。这是否因样本量原因所致，还有待进一步增加样本量，对糖尿病进行分型，并对房水、视网膜等不同部位进行FAS/FASL基因基因多态性的检测，以多方位揭示FAS/FASL基因多态性与DR的关联性。

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(2017-07-06收稿 2017-12-20修回)

AssociationofFAS/FASLgenepolymorphismswithdiabeticretinopathyinKunmingHanpopulations

ZHANG Xian1，LI Yuanyuan1，LI Xuejiang1，ZHANG Yan1,HU Tinghua2,and MA Junyan2.1.Department of Servicemen’s Wards;2.Department of Special Examination,Yunnan Provincial Corps Hospital of PAPF,Kunming 650111,China

ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of Fas promoter-1377 and FasL promoter-844 and diabetic retinopathy (DR) in Kunming Han populations.MethodsPolymerase chain reaction (PCR)and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) analysis techniques were used to screen the distribution of the genotypic and allelic frequencies of the Fas-1377 and FASL-844 gene among 31 patients with diabetic retinopathy and 23 healthy controls with normal glucose tolerance.ResultsThe frequencies of three genotypes-AA, AG and GG-at the Fas-1377 locus in the control group were 9.7%, 54.8% and 35.5%, respectively, compared to 13%, 52.2% and 34.8% respectively in the case group.There was no statistically significant difference in genotype frequency distribution between the two groups (fisher=0.282,P=1.0). Allele A and G frequency in the control group was 37.1% and 62.9% respectively, but was 39.1% and 60.9% respectively in the case group. There was no statistically significant difference between the two groups in allele frequency distribution (χ2=0.046,P=0.829). Allele frequencies of C and T in the control group were 64.5% and 35.5% respectively, compared with 78.3% and 21.7% in the case group. Logistic regression analysis of the four models suggested that FasL-844 gene T could increase the risk for diabetic retinopathy. The values of TC, TT, TC+TT and TOR were 1.885, 4.308, 2.154 and 1.980 respectively,P>0.05, so there was no statistically significant difference. At the same time,carrying FAS-1377 GG and FASL-844 CT/TT gene was more likely to increase the risk of diabetic retinopathy than carrying FAS-1377 CC genotype GG and FASL-844(OR=1.143 (95%CI=0.141-9.289);OR=0.343 (95%CI=0.052-2.261);OR=2.286 (95%CI=0.185-28.186),Pvalues>0.05.ConclusionsNeither Fas-1377 nor FasL-844 gene polymorphisms have any relationships with diabetic retinopathy in Kunming Han populations, and neither of them may be the susceptible gene of diabetic retinopathy.

diabetic retinopathy; Fas-1377; FasL-844; gene polymorphism

张 娴，硕士，主治医师。

650111 昆明，武警云南总队医院：1.军人病区，2.特检科

R774.1

梁秋野)