藏红花及其组分对兔耳微痤疮模型抗角化作用的研究

2018-04-27吕明锐王倩然王孝源

西南医科大学学报 2018年2期

吕明锐，王倩然，张锐，王孝源，汪洋

（重庆医科大学：1临床医学专业2011级；2预防医学专业2011级；3预防医学专业2013级；4实验教学管理中心，重庆 400016）

痤疮是一种最常见的发生于毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，多发生在面部和胸背部，常表现为粉刺、丘疹、脓疱、结节、瘢痕等。痤疮的发病原因比较复杂，其发病机制目前尚未完全清楚，多与雄激素、皮脂分泌、痤疮丙酸杆菌增殖、毛囊皮脂腺导管的异常角化、心理及遗传等因素有关[1]。其中毛囊皮脂腺导管炎症和角化贯穿于痤疮的整个过程。藏红花(Saffrom)为菊科植物红花的干燥花，是我国传统的活血化瘀类中药。藏红花中明确的化学成分约200种，红花黄色素(safflor yellow，SY)为藏红花的主要活性成分，属查耳酮类化合物；而羟基红花黄色素A(hydroxy saffiower yellow A,HSYA)为红花黄色素中含量较高的成分。临床上利用藏红花活血化瘀、抗菌消炎的功效，增强机体耐力，增强淋巴细胞增殖反应，以此来提高机体细胞免疫和体液免疫[2]。

角蛋白16（cytokeratin16）是角质形成细胞异常分化和过度增殖的标志,痤疮毛囊皮脂腺导管的角质形成细胞表达角蛋白16，说明了上皮的角化过度和细胞的异常增殖。痤疮毛囊中角化的角质形成细胞变得致密,细胞间粘附增加且不易脱落。导管角质形成细胞的增殖过度和内皮的脱屑障碍导致角栓形成,并阻塞了毛囊口,从而诱发粉刺的形成。目前研究表明，红花黄色素的多种药理作用与其抑制炎症反应有关。因此，我们建立兔耳微痤疮模型，通过观察藏红花用药前后兔耳毛囊皮脂腺导管的角质形成细胞表达角蛋白16的变化，探究藏红花及其组分是否可改善实验性痤疮的症状，以及是否通过抗角化的作用机制产生治疗效应。

1 材料和方法

1.1 材料

藏红花（干），产地云南；兔角蛋白16 ELISA Kit（重庆韵博科技有限公司）；表皮葡萄球菌株由重庆医科大学病原微生物室提供，经培养后，用肉汤培养基稀释为108个/mL备用；新西兰兔，雄性，体重2.0～3.0 kg，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号SCXK-(渝)2012-0001

1.2 方法

1.2.1 兔耳微痤疮模型的建立[3]

新西兰兔30只，随机分为空白对照组、模型对照组、低浓度藏红花组、中浓度藏红花组和高浓度藏红花组，每组6只。分别在新西兰兔左、右外耳道内侧耳导管开口处约2.0 cm×2.0 cm范围内外用移液器涂抹50%油酸0.2 mL，1次/d，连续15 d，建立动物痤疮模型。造模第13 d,通过肉汤培养基培育表皮葡萄球菌。造模第15 d，用1 mL注射器在用油酸造模的兔外耳道皮内注射表皮葡萄球菌30 μL，并且在注射部位周围做标记。其中空白对照组兔的双耳均不做任何处理。

1.2.2 模型评价[4]

造模第15 d随机取10只动物，各组2只，在左耳标记处取约1.5 cm×1.5 cm作皮肤活检，组织块以10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，每个标本作连续切片3张，HE染色，在显微镜下观察，各组切片中位置相同皮脂腺的直径，评价造模情况。

1.2.3 药物的准备

将干藏红花放入1 000 mL玻璃烧杯中，利用水煎法，煮沸后静置3 min，用滤网过滤掉藏红花残渣，配制成溶质含量分别为0.35 g（生药）/mL，0.7 g（生药）/mL以及1.05 g（生药）/mL的3组不同浓度的藏红花溶液。

1.2.4 治疗

经造模评价后，空白对照组及模型对照组按5 mL/kg/d给予超纯水灌胃，低浓度藏红花组按5 mL/kg/d给予藏红花水提取液（含藏红花溶质0.35 g/mL）灌胃，中浓度藏红花组按5 mL/kg/d给予藏红花水提取液（含藏红花溶质0.7 g/mL）灌胃，高浓度藏红花组按5 mL/kg/d给予藏红花水提取液（含藏红花溶质1.05 g/mL）灌胃。给药频率为1次/d,连续给药15 d。

1.2.5 取样

末次给药20 h后，在注射部位标记处静脉取血1.5 mL/管，按不同组别立即行3 000 r/min离心15 min，分离血清，利用ELISA法测定血清角蛋白16含量。同时，取右耳标记处取约1.5 cm×1.5 cm作皮肤活检，组织块以10%福尔马林固定，石蜡包埋，切片，每个标本作连续切片3张，HE染色后在光镜下观察各组切片中位置相同皮脂腺病理形态学变化。

1.2.6 数据处理

应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料用±s（均数±标准差)表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD法，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 皮脂腺角化程度病理学观察

光镜下观察HE染色结果显示（图1），藏红花水提液灌胃治疗前后各剂量组毛囊皮脂腺角化程度均有明显变化。治疗后第15 d毛囊面积较治疗前时有明显缩小，角质层角化过度情况有所减轻，毛囊上皮颗粒层，棘细胞层增生明显，毛囊口和漏斗部均有角质物形成，炎症细胞较治疗前减少，表皮细胞角化层完整性逐步恢复。

图1 各组兔耳微痤疮模型组织形态学比较（HE染色，×100）

2.2 各组血清角蛋白16(CK16)表达

空白对照组、低浓度和中浓度藏红花组血清CK16的表达比模型对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。高浓度藏红花组血清CK16的表达与模型对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组兔血清角蛋白16表达的比较±s，μg/mL)

注：a表示与模型对照组比较，P＜0.05。

组别空白对照组模型对照组低浓度藏红花组中浓度藏红花组高浓度藏红花组n66666 FP CK16 0.667±0.004a 0.647±0.004 0.676±0.005a 0.673±0.008a 0.658±0.115 11.117 0.002

3 讨论

痤疮是由于毛囊及皮脂腺阻塞引发的一种慢性炎症性皮肤病，好发于颜面、胸背部等皮脂腺丰富的部位。影响皮肤美观,给患者的容貌造成负面影响，甚至可导致患者自卑、悲观等不良情绪的产生，严重影响患者心理健康[5]。其发病一般认为与内分泌因素(特别是雄性激素)、毛囊皮脂腺导管角化异常、微生物感染、饮食、情绪、某些化学因子及药物等有关，但具体发病机制并不明确[6]。中医中药在痤疮治疗中起到一定作用。

藏红花(carthamus tinctorius L，CT)为菊科植物红花的干燥花，是我国传统的活血化瘀类中药。现代药理学实验发现它具有降血压、抗凝血、抗氧化、抗癌、免疫调节等作用。同时还发现其通过抑制致炎因子表达，提升抗炎因子的表达水平，并在机体不同病理状态下发挥抗炎作用、减轻炎症反应、改善机体抵抗力，从而达到治疗相应疾病的作用[7]。

研究发现，角蛋白16是表皮角质形成细胞主要的结构蛋白之一,在维持细胞功能及皮肤屏障功能方面起着重要作用。角蛋白16的表达高度依赖角质形成细胞状态和分化程度，在不同类型的上皮细胞内表达程度也不相同。

本实验建立兔耳微痤疮模型，通过不同浓度藏红花溶液灌胃观察痤疮治疗效果。结果发现，藏红花水提液组连续使用15 d后，各剂量组家兔毛囊皮脂腺导管病理学切片中可见明显缩小的微痤疮表皮厚度、毛囊面积及皮脂腺直径，皮脂腺导管角化层与刚完成造模时相比，其完整性明显恢复；且各藏红花组的恢复情况均优于模型对照组。提示藏红花及其组分具有促进毛囊损伤修复的作用。此外，ELISA法测定各组皮脂腺损伤部位血清中角蛋白16（CK16）表达水平后发现，当藏红花溶液浓度处于低浓度（含藏红花溶质0.35 g/mL）及中浓度（含藏红花溶质0.7 g/mL）时，实验组与模型对照组存在明显统计学差异（P＜0.01），提示当藏红花溶质浓度在0.35～0.7 g/mL这一浓度区间时,藏红花及其组分可通过促进血清CK16蛋白表达，修复胶质细胞中的骨架蛋白，维持上皮细胞的完整性和连续性，从而达到对兔耳微痤疮的治疗作用。但高浓度藏红花水提液未观察到血清CK16显著升高，推测此时对痤疮的修复作用可能还涉及其它机制，需进一步实验研究证实。