树突状细胞在睾丸原发性淋巴瘤组织中的免疫表型分析

朱昱宏，刘 冲，郑文忠，董道全，张恩溥，范龙龙，李贤新,2

(1.北京大学深圳医院泌尿外科，广东省男性生殖与遗传实验室，广东深圳 518036； 2.深圳市孙逸仙心血管医院外科，广东深圳 518112； 3.郑州大学附属第一医院妇产科，河南郑州 450052)

睾丸原发性淋巴瘤(primary lymphoma of testis，PLT)是一种罕见的结外非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin lymphoma，NHL),约占睾丸恶性肿瘤的5%，占NHL的1%～2%[1]。其主要临床病理类型为弥漫性大B细胞淋巴瘤[2]。研究发现，睾丸免疫环境异常与PLT免疫监视机制衰减及免疫逃逸密切相关[3]。我们前期研究发现，树突细胞免疫表型及胞内因子异常在睾丸精原细胞瘤发生发展过程起重要作用[4]。本研究通过免疫组化(immunohistochemistry，IHC)染色技术检测树突状细胞(dendritic cells，DCs)亚群(myeloid DCs、stromal DCs、plasmacytoid DCs)在正常及PLT睾丸组织中的表达及分布，并分析DCs在PLT发病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1标本收集与制备筛选符合研究标准PLT睾丸病理组织石蜡标本(7例)、年龄在45至60岁之间，正常睾丸组织标本(10例)、年龄在34至59岁之间，登记病例资料(用药史、外伤史、和生育史等)、诊断标准和筛选标准，并填写《知情同意书》。本研究正常对照睾丸组织标本选自2009～2012年我院泌尿外科前列腺癌睾丸去势手术或睾丸外伤行睾丸切除患者，PLT标本选自2005～2016年我院泌尿外科因睾丸肿瘤行睾丸切除术者。纳入本研究标准为：睾丸(及附属结构)为首要诊断部位，诊断3个月后未见其他器官病灶，我院2名病理科医师同时确定诊断为PLT(弥漫性大B细胞淋巴瘤)。所有样本均经过多聚甲醛固定(4%浓度)并常规石蜡包埋处理备用。

1.2主要试剂及仪器CD11c鼠抗人单克隆抗体(武汉三鹰公司)，CD1a鼠抗人多克隆抗体(Abcam，UK)，DC-SIGN兔抗人多克隆抗体(Abcam，UK)，BDCA-2 兔抗人单克隆抗体(武汉三鹰公司)，IDO兔抗人多克隆抗体(Abcam，UK)，CD83鼠抗人多克隆抗体(Abcam，UK)，HLA-DR鼠抗人单克隆抗体(Abcam，UK)，DAB(福州迈新生物科技有限公司)，UltraSensitiveTM SP(鼠/兔)试剂盒(福州迈新生物科技有限公司)，莱卡显微镜DM4000b。

1.3免疫组织化学染色(二步法) 石蜡标本切片，切片厚度为5 μm，附于防脱玻片，烘干处理。二甲苯脱蜡处理(两次，每次20 min)，进行梯度乙醇水化标本(100%、100%、95%、95%、80%、75%)。过氧化氢(0.3%)避光孵育20 min，Tris-EDTA(pH=10.00)微波加热修复20 min，自然冷却。BSA封闭45 min(室温)，一抗(最远浓度)4度冰箱孵育过夜，二抗温箱(37 ℃)孵育45 min，DAB显示反应，苏木紫染核，水化及透明处理，中性树胶封片。阴性对照采用相应IgG替代一抗孵育过程。

2 结 果

2.1CD11c在正常及PLT睾丸组织中的表达与分布正常睾丸可见少量CD11c+mDCs表达分布于睾丸间质区域，精曲小管内生精细胞亦可见CD11c表达；PLT组织内可见大量CD11c+mDCs呈浸润性分布；二者组间差异有显著性(P<0.05)(图1)。

2.2DC-SIGN在正常及PLT睾丸组织中的表达与分布正常睾丸可见少量DC-SIGN+sDCs表达分布于睾丸间质区域，精曲小管内生精细胞及支持细胞亦可见DC-SIGN表达；PLT组织内可见大量DC-SIGN+sDCs呈浸润性分布；二者组间差异有显著性(P<0.05)(图1)。

2.3CD1a在正常及PLT睾丸组织中的表达与分布正常睾丸可见少量CD1a+DCs表达分布于睾丸间质区域；PLT组织内可见CD1a+DCs散在分布；二者组间差异有显著性(P<0.05)(图1)。

2.4BDCA-2在正常及PLT睾丸组织中的表达与分布正常及PLT睾丸组织均可见少量BDCA-2+浆样树突状细胞(plasmacytoid DCs，pDCs)呈散在分布，；二者组间差异无显著性(P>0.05)(图2)。

2.5HLA-DR、CD83及IDO在正常及PLT睾丸组织中的表达与分布正常睾丸可见少量HLA-DR+细胞散在分布于睾丸间质区域，PLT组织内可见大量HLA-DR+细胞呈浸润性分布；二者组间差异有显著性(P<0.05)(图3)；正常睾丸可见IDO呈散在分布于睾丸间质区域，PLT组织内可见大量IDO+细胞呈浸润性分布，二者组间差异有显著性(P<0.05)(图3)；本研究未发现CD83+DCs在正常及PLT睾丸组织中表达。

图1IHC分析CD11c、DC-SIGN、CD1a在正常及PLT睾丸组织中的表达(×200；×400)及其柱状图

A:CD11c的表达；B：DC-SIGN的表达；C：CD1a的表达。小线框(×200)代表目标区域；右下角大方框代表目标区域×400视野；*代表生精小管管腔；箭头代表阳性细胞。标尺为100 μm。

图2 IHC 分析BDCA-2在正常及PLT睾丸组织中的表达(×200；×400)及其柱状图

小线框(×200)代表目标区域；右下角大方框代表目标区域×400视野；*代表生精小管管腔；箭头代表阳性细胞。标尺为100 μm。

图3 IHC 分析HLA-DR及IDO在正常及PLT睾丸组织中的表达(×200；×400)及其柱状图

A:HLA-DR的表达；B：IDO的表达。小线框(×200)代表目标区域；右下角大方框代表目标区域×400视野；*代表生精小管管腔；箭头代表阳性细胞。标尺为100 μm。

3 讨 论

PLT是一类较为罕见的结外淋巴瘤，常见于老年患者[5]。绝大多数PLT为NHL，主要病理类型为弥漫性大细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或其它病理类型少见[6]。免疫表型方面，PLT主要为B系、T系及T/NK细胞性淋巴瘤少见[7-8]。PLT发展快速，预后较差，其5年生存率为16%～50%[9]。研究表明，睾丸免疫环境异常与免疫监视机制衰减及肿瘤细胞免疫逃逸过程密切相关[4]。本研究通过IHC分析正常及PLT患者睾丸组织中DCs亚群及分布，发现DCs在PLT患者睾丸组织中表达水平显著增高，提示睾丸DCs异常在PLT免疫监视机制衰减及肿瘤细胞免疫逃逸过程中可能发挥重要作用。

DC是最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，作为连接机体固有免疫及适应性免疫的“桥梁”，是机体产生T淋巴细胞免疫应答的始动者[10-12]。按DCs来源、分布、分化程度及免疫功能可将其分为：mDCs、pDCs、郎格汉斯细胞、sDCs、未成熟性DCs、成熟性DCs、耐受性DCs及炎症性DCs[13]。

本课题组前期研究发现，精原细胞瘤中CD11c+mDCs表达水平较正常睾丸组织显著增高，这类CD11c+mDCs呈集落状分布，并表达吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-Dioxygenase，IDO)，在诱导T淋巴细胞调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)/辅助性T细胞17(helper T cell 17，Th17)，辅助性T细胞1/辅助性T细胞2(helper T cell 1/ helper T cell 2，Th1/Th2)向耐受性极化过程中起重要作用[4]。本研究发现，PLT睾丸组织中CD11c+mDCs与IDO表达水平较正常水平显著增高，提示CD11c+mDCs可能通过表达分泌IDO调控Treg或Th2极化过程，进而参与肿瘤细胞免疫逃逸过程。

DC特异性ICAM抓取非整合素(DC-specific ICAM-grabbing non-integrin，DC-SGN)，为II型跨膜受体，是DCs表面C凝集素受体(c-type lectin receptors，CLRs)的主要成员，其可通过识别人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)包膜蛋白(gp120)捕获病毒,并将其传递给T淋巴细胞，造成T淋巴细胞免疫反应异常[14]。DC-SIGN为sDCs的相对特征标记物，在成熟型DC中表达[15]。本研究发现睾丸间质散在分布DC-SIGN+DCs，提示其在维持睾丸免疫屏障稳态中起重要作用。此外，其可作为HIV病毒残留于获得性免疫缺陷综合征患者睾丸的接合点[16]。DC-SIGN+DCs在PLT中的表达及作用至今仍无相关文献报道，本实验通过IHC染色发现PLT睾丸组织大量浸润DC-SIGN+，提示PLT睾丸组织相关DCs分化水平较高，具有一定调控T淋巴细胞分化的作用。

CD1a的生物学作用是呈递脂类抗原的分子，其作为郎格汉斯细胞(langerhans cell，LCs)的特征性标志物。LCs主要分布于表皮，其在抗病原微生物侵入及免疫监视肿瘤细胞中起关键作用[17]。本研究发现PLT睾丸组织CD1a+DCs较正常显著增加，但是CD1a总表达丰度较低，由此我们推测，PLT发生过程中CD1a+DCs表达水平升高有限，无法有效清除肿瘤细胞，造成肿瘤细胞免疫逃逸。

正常生理条件下，pDCs主要分布于外周血及次级淋巴组织器官。pDCs对机体外源性抗原物质提呈较弱，其主要通过TLR7及TLR9提呈内源性抗原物质，并可通过释放I类干扰素活化CD4+T，CD8+T及自然杀伤细胞(nature killer cells，NKs)，发挥免疫防御作用[18-19]。本研究发现正常及PLT组织中均有少量BDCA-2+pDCs表达，二者差异无统计学意义。

HLA-DR是Ⅱ类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)。本研究发现PLT及正常睾丸组织中均表达HLA-DR，且PLT睾丸组织HL-DR表达水平较正常睾丸组织显著增高，提示PLT睾丸组织相关DC，分化相对成熟，并具有一定抗原提呈功能。由此我们推测PLT发生过程中APC表达HLA-DR水平随肿瘤抗原增加而增高，但无法诱导有效的T淋巴细胞杀伤机制。

综上所述，本研究通过分析正常及PLT睾丸组织中各DCs亚群改变，发现正常睾丸间质中DCs为未完全成熟型，提示其在维持睾丸免疫屏障中发挥重要作用。在PLT患者睾丸组织中，mDC、sDCs及CD1a+DCs表达水平显著增高，且主要表现为具有一定成熟度及抗原提呈功能的耐受型DCs，提示其可能通过表达DC-SIGN、HLA-DR并分泌IDO等耐受性细胞因子调控Treg或Th2极化过程，进而参与肿瘤细胞免疫逃逸过程。本研究为精原细胞瘤免疫诊断提供新的潜在指标，对开发设计精原细胞瘤免疫治疗方案具有一定的临床意义。

值得注意的是，本研究仅通过IHC染色初步探讨PLT相关DCs的表型特征，进一步需要通过PCR、Western blot及流式细胞术进行验证。此外，仍需体外细胞功能实验研究其确切分子生物学机制。

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