光周期和红光对光唇鱼卵巢发育和机体氧化应激状态的影响

，

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2.浙江省野生动物生物技术与保护利用重点实验室，浙江 金华 321004)

昼夜交替形成的光周期是自然界中变化最恒定、变动规律最严格的信号之一，对动物的季节性繁殖起着重要的调节作用。大部分鱼类的繁殖季节与自然界光周期的季节变化间存在明显的相关性，在进化上，这有利于后代在一年当中最适宜的季节出生以保障幼体的成活率[1]。因此，在实施全人工或反季节繁育过程中，人们可根据鱼类在繁殖期对光周期的要求，利用人工照明来调控鱼类的繁殖进程[2]。

水下光谱成分会随水的深度变化而发生显著改变，如在深水区以穿透能力较强的短波光为主成分，而长波光如红光则在较浅的水层被吸收[3-4]。但是，短波光在某些浑浊水体中有可能被色素和悬浮颗粒快速吸收与分散，因而导致长波光成为主成分[5-6]。不同波段的光谱可以被鱼类视网膜视蛋白及视网膜外的光感受器所感知，生活在不同水域和水层的鱼类在长期进化过程中形成了不同的光谱敏感性，如浅水性鱼类对长波光的敏感性可能会高于深水性鱼类[4，7-8]。此外，鱼类的性腺发育和繁殖内分泌对不同波长光照的反应存在物种差异[9-11]。

褪黑素(Melatonin，MT)是一种主要由松果体和视网膜分泌的吲哚杂环类神经内分泌激素组成，其分泌受光的抑制，常表现出白天降低而夜间升高的趋势[12]。MT可通过下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamus-pituitary-gonad aix，HPG aix)正向或负向调控相关性激素分泌，从而影响鱼类的性腺发育[13-15]。MT本身作为一种抗氧化剂，可直接清除自由基，还可调节超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶酶活力[16]，从而降低氧化压力和减轻卵母细胞损伤与老化，提高卵母细胞质量[17-19]。此外，不同波段的光谱对MT分泌的调节作用存在差异，如红光等长波光穿透脑部的能力较强，可更有效地调节松果体MT的分泌[20]。

光唇鱼(Acrosssoeheilusfasciatus)隶属鲤形目、鲃亚科、光唇鱼属，主要分布于我国浙江山区溪流内，繁殖高峰期为6—7月[21]，属典型的长日照繁殖类型。该鱼作为一种具有地方特色的溪源性鱼类，受到广大消费者的欢迎。目前光唇鱼的人工繁育已基本成功，但在实践中发现母本存在明显的性腺发育不同步现象，这成为阻碍规模化繁育的技术瓶颈。为了解决这一问题，并考虑到溪流水浅且透明度高的特点，推测红光可能对光唇鱼的繁殖具有重要影响，因此本研究尝试以红光LED作为光源并结合光周期来加速光唇鱼母本的性成熟，并分析与生理状态相关的指标的变化，以期为该鱼的全人工繁育或反季节繁育提供理论指导与技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验鱼与驯化

2017年5月从浙江省遂昌县某养殖场购买处于繁殖前期的光唇鱼亲本，饲养于实验室全封闭循环水养殖系统中，在12L∶12D光周期和(23±1)℃水温下驯化2周。期间投喂某品牌全价配合饲料(粗蛋白>40%，粗脂肪>4%)，投喂时间为10∶00和16∶00，日投喂量为体重的2%～3%。循环水养殖系统水质：溶解氧>7.0 mg/L，pH 7.0～7.5，总氨氮<0.5 mg/L，亚硝酸盐<0.05 mg/L。

1.2 实验处理

挑选健康、体重均匀的雌性光唇鱼64尾[体重(30± 2)g，体长(13 ± 1)cm]，随机分为4 组(每组2个平行组，8尾/平行组)，各组给予不同的光照条件。光源分别为白色荧光灯管(10 W)和红光LED灯(632 nm)(图1)，用定时器控制两种光周期：12L∶12D和16L∶8D，共设置白光短光照(Short photoperiod with white light，SW)、红光短光照(Short photoperiod with red light，SR)、白光长光照(Long photoperiod with white light，LW)和红光长光照(Long photoperiod with red light，LR)4个组。调整灯距水面的高度，使辐照强度达到0.9 W/m2。养殖条件、投喂方式和水质控制同驯化期，实验周期45 d。

1.3 取样

养殖实验结束后，每平行组随机取4尾鱼，经MS-222溶液(800 mg/L)深度麻醉后取样。分别在12∶00和24∶00尾静脉取血，血液于抗凝离心管中离心(4℃，3 500 rmp，15 min)，收集血浆用于激素分析。卵巢称重后镜检，肝脏、肌肉组织于-80℃保存备用。

1.4 指标测定

1.4.1 性腺指数测定

鱼体和卵巢称重，精确至0.01 g，根据公式计算性腺指数(Gonadosomatic index，GSI)，公式：GSI = [性腺质量(g)/体质量(g)]×100%。

1.4.2 卵巢组织压片观察

取少量卵巢置于载玻片上，滴数滴醋酸洋红溶液，加盖玻片并轻轻挤压，使卵母细胞破裂和分散，移至显微镜(Zeiss，Germany)下观察并拍照，将卵母细胞分为卵原细胞、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期卵母细胞和闭锁卵泡5个时期[22]，统计各期卵细胞的比例。

1.4.3 血浆褪黑素(MT)含量的测定

利用酶联免疫检测(ELISA)试剂盒(IBL，Hamburg，Germany)测定血浆MT含量，试剂盒最低检测极限为0.5 ng/L，组内和组间变异系数分别小于9%和11%。血浆用量为50 μL，操作步骤参照试剂盒说明书，酶标仪(Pro200，TECAN，Switzerland)于450 nm波长处测定样品吸光度(OD值)，并根据标准曲线计算样品浓度。

1.4.4 组织氧化还原状态评估

将肌肉或肝脏组织剪碎后加入4 倍体积(W/V)预冷的生理盐水，用组织匀浆机制成匀浆，以3 000 r/min转速4℃离心5 min，取上清液用于丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量和SOD酶活力测定，步骤参照试剂盒说明书(南京建成生物技术研究所)。组织蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。MDA含量单位为nmol·mgprot-1，SOD酶活力单位为U·mgprot-1。

1.5 数据分析

用SPSS10.0软件进行统计分析，数据以平均值±标准误(Mean ± SE)表示。以光周期和光色作为两因子，采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)比较组间差异，当检测出各组间有统计差异后，利用Turkey法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 性腺发育

光周期和光色对雌性光唇鱼性腺指数(GSI)(A)和不同发育阶段卵母细胞相对百分数(B)的影响，结果如图2所示。红光长光照组(LR)雌性光唇鱼性腺指数(GSI)和Ⅲ期卵母细胞比例最大，而白光短光照组(SW)最小(P<0.05)。在白光下，长光照可显著增加GSI和提高Ⅱ、Ⅲ 期卵母细胞的比例(P<0.05)，并显著降低卵原细胞的比例。在红光下，长光照组(LR)GSI和Ⅲ期卵母细胞比例均显著高于短光照组(SR)(P<0.05)。在相同光周期下，与白光组(SW或LW)相比，红光均能显著诱导GSI和Ⅲ期卵母细胞比例的增加，并降低卵原细胞的比例(P<0.05)。光周期和光色对GSI和Ⅲ期卵母细胞比例的影响具有明显的交互作用(P<0.05)。

2.2 血浆MT含量

由图3可知，各组夜间血浆褪黑素(MT)含量普遍高于日间(P<0.05)，红光长光照组(LR)夜间血浆MT水平最高，而白光短光照组(SW)最低(P<0.05)。在白光下，长光照组(LW)无论日间还是夜间血浆MT水平均显著高于短光周期组(SW)(P<0.05)。在红光下，长光照可显著提高日间或夜间的血浆MT水平(P<0.05)。在两种光周期条件下，与白光相比，红光均能显著提高夜间血浆MT水平(P<0.05)，但对日间MT水平无显著影响(P>0.05)。光周期与光色对夜间血浆MT水平的影响同样具有极显著的交互作用(P<0.01)。

注：SW：白光短光照；SR：红光短光照；LW：白光长光照；LR：红光长光照；不同字母表示各组间具有显著差异(P<0.05)，n=8；下同。

Notes：SW：short photoperiod with white light；SR：short photoperiod with red light；LW：long photoperiod with white light；LR：long photoperiod with red light.Different letters meant significant difference among groups(P<0.05)，n=8；the same as below.

2.3 肌肉和肝脏MDA含量和SOD酶活力

光周期和光色对肌肉组织MDA含量和组织SOD酶活力无显著影响(P>0.05)(图4)。红光长光照组(LR)肝脏MDA含量最高，而白光短光照组(SW)最低(P<0.05)。长光照组(LW和LR)肝脏MDA含量均显著大于相同光色的短光照组(SW和SR)(P<0.05)。在长光周期下，红光组(LR)肝脏MDA含量显著高于白光组(LW)(P<0.05)，但在短光周期下，红光和白光组(SR和SW)间无统计差异。光周期和光色仅对肝脏MDA含量具有明显的交互作用(P<0.05)。

3 讨论

光周期是调控鱼类季节性繁殖最重要的生态因子之一，温带鱼类大部分属于长日照繁殖类型，因此利用长光照能够促进这些鱼类的繁殖，相关研究已有大量报道[2，23-24]。野生光唇鱼的繁殖主要集中在每年6—7月[21]，此阶段自然界光照时间达到峰值，因此其繁殖属于典型的长日照繁殖类型。本研究中，长光周期(16L∶8D)显著提高了光唇鱼的性腺指数，加速了卵母细胞的发育，这与其繁殖类型相一致。

鱼类松果体和视网膜作为光感受器对光谱具有特殊吸收峰，而特定波段的光谱对鱼类的繁殖调控存在物种差异。水下光环境与陆地光环境存在巨大的差异，因为部分阳光在辐射时，首先在水面被反射，而通过折射进入水中的光又进一步发生散射，光谱组成和光强度随着水深的增加而发生明显的改变[5]，但长波光仅能穿透到较浅的水层[4]。因此，生活在海水或淡水不同水层的鱼类可能对不同波长的光谱产生适应性进化。利用电生理技术可以在鱼类的松果体中检测到两种光色素(视紫红质和视紫质)，如金鱼(Carassiusauratus)松果体光受体的最大吸收峰为530 nm[25]，而虹鳟(Oncorhynchusmykiss)在500 nm和533 nm处均存在最大吸收峰[26]。鱼类视网膜内存在长波、中波、短波、紫外四种视锥色素蛋白，但每种视蛋白的吸收峰存在较大的物种差异。如金鱼视锥色素蛋白分别在620、540、440、360 nm处存在最大吸收峰[27-31]，而条纹鲈(Moronesaxatilis)在542 nm和605 nm存在最大吸收峰[32]。Bapary等研究了不同颜色光照对蓝刻齿雀鲷(Chrysipteracyanea)卵巢发育的影响，结果表明红光(627 nm)可显著增加浅水性鱼类的GSI，而且只有在红光下卵巢中出现了含有卵黄的卵母细胞[9]。类似地，红光(640 nm)可诱导斑马鱼胚胎数量的增加[11]。本研究中在两种光周期下红光(626 nm)均能显著增加光唇鱼的GSI和卵母细胞的成熟度，说明红光对其性成熟具有明显的促进作用，与上述研究结果相一致。然而，有研究发现红光(627 nm)可抑制副金翅雀鲷(Chrysipteraparasema)的性成熟[33]。还有研究表明红光(630 nm)可抑制金鱼神经激素kisspeptin、促性腺激素(Gonadotropin hormones，GTHs)、P450芳香化酶(Cytochrome P450 aromatase，P450 arom)等性成熟相关激素的表达[10]。因此，鱼类繁殖对光色的反应存在明显的物种差异。

在脊椎动物中，褪黑素(MT)主要由松果体和视网膜分泌，其分泌量和昼夜节律受到光周期的调控[34]。光信号可转化成MT信号将时间信息传递至大脑，进而通过HPG轴影响鱼类的繁殖。切除松果体显著抑制了金体美鳊(Notemigonuscrysoleucas)[35]和金鱼[36]的性腺发育，却可促进青鳉(Oryziaslatipes)的性成熟[37]。如MT处理可诱导斑马鱼GSI、排卵量的增加，以及促进繁殖相关基因的表达[38]。饲料内添加MT(50 μg/g)可以显著促进大马哈鱼(Oncorhynchusketa)性激素的分泌，但添加量提高十倍会起到反作用[13-14]。因此，MT对鱼类繁殖的促进作用存在剂量效应，甚至存在负作用。有趣的是，长光照暴露可促进切除松果体和摘除眼球的鲶鱼(Heteropneustesfossilis)的性腺发育[39]。目前已有很多报道表明鱼类、两栖类等脊椎动物脑内均检测到了光受体基因表达，有的还可检测到MT合成关键酶芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase)基因的表达[40-42]，这暗示光信号还可以通过视网膜和松果体外的光感受器影响鱼类的繁殖生理，而MT在此过程中充当了重要角色。除光周期外，某些特定波段的光谱对褪黑素分泌具有特殊的调节作用，因此对鱼类繁殖的影响也存在差异。如红光可促进塞内加尔鳎(Soleasenegalensis)[43]和欧洲齿舌鲈(Dicentrarchuslabrax)[44]MT分泌。本研究表明：长光照同时提高了雌性光唇鱼日间和夜间的血浆MT水平，尤其以红光作为光源时夜间血浆MT水平最高，且MT水平越高，其卵巢的成熟度也越高，这暗示长光照和红光照射可以协同促进该鱼的性腺发育，而MT在其中可能扮演了重要的调控角色。

在环境压力下机体产生的活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)会导致细胞膜脂质过氧化(Lipid peroxidation，LPO)，从而影响细胞的存活[45]，而特定波段的光谱可增加或抑制鱼体的氧化压力。如蓝光照射有助于提高尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的抗胁迫能力[46]。Shin等研究表明绿光和蓝光可以通过提高克氏双锯鱼(Amphiprionclarkii)体内抗氧化物质的水平，而红光则可诱导氧化压力[47]。在本研究中，红光长光照导致了雌性光唇鱼肝脏脂质过氧化物水平的提高，说明红光对鱼体造成了氧化压力，与上述研究结果较一致。然而，本研究还发现红光虽然对关键抗氧化酶SOD酶活力无显著影响，但是提高了血液中MT的水平，而MT作为强抗氧化物质，在一定程度上可缓解由红光引起的氧化压力。

综上所述，在循环水养殖条件下以626 nm红光结合长光周期(16L∶8D)可协同加速雌性光唇鱼的性腺发育，从而提高亲本繁殖的同步化水平。血浆褪黑素(MT)与性腺指数和卵细胞发育存在一定的相关性，这暗示褪黑素在鱼类繁殖调控方面发挥了重要作用。

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