海洋链霉菌IMB3-202产生的吲哚咔唑生物碱

王冕，郝晓萌，李娇，胡媛媛，关艳，王以光，甘茂罗，肖春玲

吲哚咔唑（indolocarbazole）生物碱是一类具有吲哚[2,3-α]-吡咯并[3,4-c]咔唑母核结构的天然产物，具有良好的抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗病毒和神经保护等生物活性[1-2]。该类化合物作用于拓扑异构酶以及与细胞周期有关的激酶，如酪氨酸蛋白激酶（PTKs）、蛋白激酶 A（PKA）、蛋白激酶 C（PKC）等多个作用靶点，其抗肿瘤活性引起广泛的关注。自 1977 年第一个吲哚咔唑生物碱——星形孢菌素（staurosporine）发现以来，从多个属的放线菌、黏细菌、蓝细菌以及海洋无脊椎动物中，分离得到 130 多个吲哚咔唑天然产物[2]。多个吲哚咔唑衍生物作为抗肿瘤药物进入临床研究[2-3]。2017年 4 月，美国食品药品管理局批准了第一个吲哚咔唑类药物——米哚妥林（midostaurin，PKC412）上市，用于治疗 FLT3 突变阳性的急性骨髓性白血病[4]，表明该类化合物具有良好的临床应用开发前景。

在从海洋放线菌筛选新抗生素的过程中，我们对黄海分离的放线菌发酵产物进行抗肿瘤细胞活性筛选[5-8]。为了解菌株的次级代谢潜能，对部分阳性菌株进行了基因组测序。利用 AntiSMASH 4.0对菌株基因组次级代谢基因进行分析，发现海洋链霉菌Streptomycessp. IMB3-202 基因组中一条基因簇与吲哚咔唑类化合物的生物合成基因非常相似，提示该菌株具有产生吲哚咔唑的次级代谢潜能。为获得该类化合物，通过优化发酵条件和系统分离纯化，分离得到 4 个吲哚咔唑衍生物，包括星形孢菌素（1）[9-10]、3'-O-去甲基星形孢菌素（2）[11]、holyrine A（3）[12]和 K252c（4）[13]。本文主要介绍菌株的基因组序列分析、分离纯化、结构鉴定以及活性评价等结果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株 菌株 IMB3-202 分离自中国大连黄海黑石礁海湾（38°49'N，121°34'E）深度约为 40 m的海洋沉积物。通过 16S rRNA 基因（GenBank No. HM467146）序列 Blast 比对分析，该菌株与新霉素链霉菌 Streptomyces fradiae（GenBank AB184776）相似度达 98.17%，确定该菌株为链霉菌属放线菌。菌株 IMB3-202 中的星形孢菌素生物合成基因簇部分序列数据提交 GenBank 保存（No.MG489830）。

1.1.2 培养基 斜面培养基（R-ISP4 培养基）：淀粉 10 g、磷酸二氢钾 1 g、硫酸镁 1 g、氯化钠1 g、硫酸铵 2 g、碳酸钙 2 g、麦麸 30 g、海盐30 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0。发酵培养基 1：酪蛋白胨 5 g、丙三醇 5 ml、酵母浸膏 1 g，ddH2O 至1 L，pH 7.0。发酵培养基 2：蔗糖 40 g、NH4Cl 2 g、Na2SO42 g、K2HPO41 g、MgCl2·6H2O 1 g、NaCl 1 g、CaCO32 g、ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。发酵培养基 3：淀粉 10 g、酵母膏 4 g、蛋白胨 2 g、KBr 10 mg、FeSO4·7H2O 4 mg，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。发酵培养基 4：酵母膏 2 g、麦芽糖10 g、葡萄糖 4 g、ddH2O 至 1L，pH 7.0 ～ 7.2。发酵培养基 5：胰蛋白胨 10 g、酵母膏 5 g、甘氨酸0.5 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。发酵培养基 6：淀粉 25 g、葡萄糖 5 g、蛋白胨 3 g、牛肉膏 3 g、CaCO32.5 g、FeSO41 mg、MnCl21 mg、ZnSO41 mg、CuSO41 mg、CoCl21 mg，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～7.2。发酵培养基 7：淀粉 10 g、葡萄糖 25 g、棉籽饼粉 10 g、蛋白胨 3 g、KH2PO40.1 g、MgSO40.1 g、NaCl 5 g、CaCO35 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0。发酵培养基 8：胰蛋白胨 3 g、酪蛋白 4 g、葡萄糖 5 g，ddH2O 至 1 L，pH 7.0 ～ 7.2。

1.1.3 仪器与试剂1H 和13C-NMR 谱用Bruker 600 MHz 核磁共振仪测定（溶剂峰为内标）；LC-MS 分析用安捷伦 LC-MSD-Trap/SL 液相色谱-质谱联用仪（1200 系列）；化合物 HPLC 制备用岛津 LC-20AD 液相色谱仪（SPD-M20A 型紫外检测器）。Amberlite XAD7HP 大孔树脂为美国罗门哈斯公司产品；Sephadex LH-20 凝胶为美国 GE Biosciences 公司产品；Cosmosil C-18 色谱柱为日本 Nacalai 公司产品；薄层色谱硅胶购自青岛海洋化工厂分厂；人工海盐购自天津中盐海洋生物公司。基因组扫描图测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 发酵条件优化与产物分析 将保存的菌株 IMB3-202 孢子悬液涂布于 R-ISP4 培养基，28 ℃ 静置培养 10 d。将活化的菌株接种到每瓶含100 ml 的发酵培养基 1 ～ 8 的 500 ml 三角瓶中，每种培养基分别采用添加 3% 人工海盐（1A ～ 8A）和不加海盐（1B ～ 8B）两种组成形式。于 28 ℃、200 r/min 条件下振荡培养 5 d，获得发酵培养物。发酵液离心获得上清液，上清液上 XAD7HP 树脂柱层析，分别用水和丙酮洗脱。收集丙酮洗脱馏分，减压蒸馏后得到提取物浸膏，将浸膏溶解于 5 ml甲醇中，10 000 r/min 离心 10 min，取上清液 5 μl进行 LC-MS 分析。色谱柱：Capcell MG II C18，3 μmol/L，3.0 mm × 150 mm；柱温：30 ℃；流动相：A 相为 5 mmol/L 醋酸铵水溶液，B 相为乙腈；梯度：0 ～ 30 min，10% ～ 90% B。流速：0.5 ml/min；检测波长：280 nm。

1.2.2 发酵产物的分离纯化 将活化的 IMB3-202菌种接种于含 100 ml 7A 培养基的 500 ml 三角瓶中，28 ℃、200 r/min 振摇培养 120 h，获得发酵培养物，共 25 L。将发酵培养物离心得到菌丝体与上清液两部分。上清液经 XAD7HP 大孔树脂柱色谱（5 L），依次用水、50%、100% 丙酮洗脱，收集 50% 和 100% 丙酮洗脱馏分，减压浓缩得到相应的提取物浸膏；菌丝体经丙酮超声提取 3 次，合并提取液，减压浓缩得到菌丝体提取物。活性检测表明，50%、100% 丙酮洗脱馏分和菌丝体提取物均具有抗菌活性。将上述活性部分合并，得到活性组分浸膏共 32.2 g。将该浸膏上硅胶柱层析（600 g），二氯甲烷-甲醇梯度（100:1、50:1、20:1、9:1、4:1、2:1、0:100，V/V）洗脱，经 TLC 板和活性检测，合并相似馏分得到 7 个组分（F1～F7）。组分 F3（600 mg）经 Sephadex LH-20 柱色谱，二氯甲烷-甲醇 1:1 洗脱，得到 3 个混合组分（F3-1～ F3-3）。组分 F3-1（200 mg）经 HPLC 制备[25% 乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液为流动相，流速5 ml/min]纯化得到化合物 1（100 mg）。组分 F3-2（50 mg）经 HPLC 半制备[30% 乙腈（含 0.1%甲酸）溶液为流动相，流速 5 ml/min]纯化得到化合物 3（3 mg）。F3-3（26 mg）经 HPLC 半制备[40%乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液为流动相，流速 5 ml/min]纯化得到化合物 4（2 mg）。组分 F4（500 mg）经Sephadex LH-20 柱色谱，二氯甲烷-甲醇 1:1 洗脱得到 4 个混合组分（F4-1～ F4-4），组分 F4-3经 HPLC半制备[23% 乙腈（含 0.1% 甲酸）溶液为流动相，流速 5 ml/min]纯化得到化合物 2（2 mg）。

1.2.3 抗菌活性测定 活性检定菌株包括铜绿假单胞菌（ATCC27853）、铜绿假单胞菌11（敏感株）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、摩氏摩根菌（ATCC 25830）、摩氏摩根菌 KL-225（多重耐药菌）、金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、金黄色葡萄球菌 R6101（甲氧西林耐药）、枯草芽孢杆菌（ATCC6633）、白色念珠菌（ATCC93025）购自 ATCC 或临床收集，由本课题组保存。活性跟踪，以摩氏摩根菌作为检定菌采用纸片扩散法进行[14]。化合物的最低抑制浓度（MIC）采用文献[15]报道的 96 孔板微量肉汤稀释法进行。

1.2.4 细胞毒活性测定 细胞毒活性采用 MTT比色法测定[16]。用胰酶消化对数生长期的细胞，以200 μl/孔、含 4000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，置于培养箱中培养。24 h 后按照实验需要加入不同浓度的药物，每个浓度设有 3 个平行复孔；药物作用 48 h 后，每孔加入 20 μl 噻唑蓝，置于培养箱中培养，4 h 后，吸出 96 孔板中所有液体，每孔加入 150 μl DMSO 溶液，置于水平摇床振荡20 ～ 30 min，在酶标仪 570 nm 下测定吸光度值（A）。细胞存活率 =（A加药组–A空白组）/（A对照组–A空白组）× 100%。根据细胞成活率计算半数抑制浓度。空白组为无细胞的完全培养基，对照组为无药细胞组。

2 结果

2.1 基因组生物信息学分析

利用 Illumina Hiseq 4000 测序平台获得的菌株3-202 基因组扫描图包含 630 个重叠群（contig），碱基总数为 6.4 Mb。利用 antiSMASH 3.0[17]对菌株 3-202 基因组进行次级代谢生物合成基因分析，提示其基因组中包含 20 个次级代谢基因簇，可能的产物类型有铁载体、非核糖体肽（NPRS）、萜、氨基糖苷、聚酮（PKS）、吲哚类等。其中位于重叠群 ctg75 中的基因簇clu7，与吲哚咔唑类化合物星形孢菌素（sta，GenBank No. AB088119）[18]、蝴蝶霉素（reb，AB071405）[19]、cladoniamide A（cla，JN165773）[20]、K252a（ink，DQ399653）[21]和reductasporine（red，KP274854）[22]等基因簇高度相似（图 1）。生物信息学分析表明，基因簇clu7含有 13 个基因，其中orf3-5和orf8分别编码L-氨基酸氧化酶、色吡咯酸合成酶、细胞色素 P450以及单氧化酶（表 1）。它们分别与来自链霉菌TP-A0274 的sta基因簇中的staO（蛋白一致性82%）、staD（蛋白一致性 72%）、staP（蛋白一致性 74%）、staC（蛋白一致性 79%）为同源基因，这些基因编码蛋白负责吲哚[2,3-α]-吡咯并[3,4-c]咔唑母核结构的合成[23]；基因orf6和orf7分别编码N-甲基转移酶和O-甲基转移酶，与sta中的staMA和staMB为同源基因，分别催化星形孢菌素氨基糖单元（L-ristosamine）的 4'-NH2和 3-OH甲基化反应[24]；orf1编码细胞色素 P450，orf2 编码 N-糖基转移酶，这两个基因与sta中催化吲哚咔唑母核与糖基偶联反应的两个蛋白 StaN 和StaG 具有较高的同源性（85% 和 78%）。此外，clu7中还含有转运及耐药等相关基因（orf10、11、13）。从图 1 所示吲哚咔唑类化合物的基因簇可知，cladoniamide A 基因簇cla中同时含有O-甲基和N-甲基转移酶基因（claM1 和claM3），但缺少糖基合成及连接相关基因；蝴蝶霉素（reb）和K252a（ink）基因簇中仅含有O-甲基转移酶基因（rebM和inkM），reductasporine 基因簇（red）中不存在甲基转移酶基因；只有sta中同时包含母核合成、糖基合成与连接、O-甲基、N-甲基转移酶等基因。因此，clu7的基因组成与sta相似度最高。根据以上分析，推测菌株 3-202 中clu7的产物可能是星形孢菌素类化合物。

图1 clu7 与其他吲哚咔唑类化合物生物合成基因簇的比较Figure 1 Comparison of clu7 and indolocarbazole biosynthetic gene clusters

表1 海洋链霉菌 IMB3-202 clu7 中各片段的功能预测Table 1 Deduced functions of ORFs in clu7 in Streptomyces sp. IMB 3-202

2.2 发酵产物分析

为获得基因簇clu7的表达产物，我们采用8 种发酵培养基，分别添加 3% 人工海盐（1A ～8A）和不加海盐（1B ～ 8B），对菌株 IMB3-202 进行发酵。利用多重耐药摩氏摩根菌 KL-225 对发酵产物进行抗阴性菌活性测定，结果显示 5A、5B、6A、6B 和 7A 发酵液显示出显著的抗菌活性（抑菌圈 15 ～ 17 mm）。对 7A 培养基发酵产物进行进一步的 LC-MS 分析（图 2），部分发酵产物中有一些组分显示出吲哚咔唑类的特征紫外光谱，质谱显示出m/z467 [M+H]+的准分子离子，提示代谢产物中含有星形孢菌素类化合物[25]。其中，以 7A发酵液中星形孢菌素类成分含量较高，且产物多样性较丰富。因此，选用 7A 培养基对菌株进行大量发酵和分离纯化。

2.3 结构解析

化合物 1（图 3）为浅黄色粉末，电喷雾质谱（ESIMS）显示准分子离子峰m/z467 [M+H]+，结合 NMR 数据推测其分子式为 C28H26N4O3。化合物 1 的紫外（UV）光谱在 244、292、334、354、371 nm 显示出最大吸收峰；1H-NMR 在低场区显示出 2 组 1,2-二取代芳香质子信号，1 个糖端基质子；高场区显示出 2 个连氧或连氮次甲基质子，4 个亚甲基质子以及 3 个甲基质子。13C-NMR 谱显示出 28 个碳信号，DEPT 谱表明这些碳信号分别为 3 个甲基碳（包括 1 个甲氧基δC60.0 和1 个氮甲基δC32.1），2 个亚甲基碳，11 个次甲基（包括 8 个 sp2杂化碳，3 个连氧或氮取代 sp3杂化碳），12 个季碳（包括 1 个羰基碳，10 个芳香碳和 1 个 sp3杂化碳）。以上数据表明，化合物 1 具有吲哚咔唑类化合物的典型 NMR 数据特征[10]。通过与文献[9-10]报道的波谱数据比对，确定化合物 1 的结构为星形孢菌素。

图2 菌株 IMB3-202 在 7A 培养基中的发酵产物 LC-MS 紫外 280 nm 色谱图（A）和总离子流图（B）Figure 2 LC-MS profile at 280 nm (A) and MS total ion current (B) of the extracts from Streptomyces sp. IMB3-202 cultured in 7A medium

图3 化合物 1 ～ 4 的结构Figure 3 The structures of compounds 1 - 4

化合物 2（图 3）的分子式依据 ESIMS 和NMR 数据确定为 C27H24N4O3。化合物 2 的 NMR数据比化合物 1 少 1 个甲氧基信号。此外，C-3'向高场位移 –9.2 ppm，H-3' 向低场位移 0.55 ppm，提示化合物 2 为 1 的 3'-O-去甲基衍生物，结构确定为 3'-O-去甲基星形孢菌素[11]。化合物 3（图 3）的分子式确定为 C26H24N4O3，不饱和度为 17，比化合物 1 的不饱和度少 1 个。与化合物 1 比较，化合物 3 的 NMR 数据中缺失了氮甲基与甲氧基的信息，提示化合物 3 为星形孢菌素的 3'-O-去甲基-4'-N-去甲基衍生物。此外，化合物 3 中 C-2' 为次甲基信号（δH4.70，q；δC78.4），并且 C-2' 的化学位移较化合物 2 中向高场位移 –15.5 ppm，说明化合物 3 中 C-2' 与 N-13 之间的 C-N 键发生断裂。通过与文献[12]数据比较，3 的波谱数据与 holyrine A 一致，因此化合物 3 的结构确定为holyrine A。化合物 4（图 3）的 MS、NMR 波谱显示其糖单元部分的信号缺失，其结构确定为星形孢菌素的苷元 K252c[13]。

星形孢菌素（1）：淡黄色粉末状；UV（MeOH，HPLC）λmax244、292、334、354、371 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）数据见表 2；ESIMSm/z：467[M+H]+，933[2M+H]+。

3'-O-去甲基星形孢菌素（2）：淡黄色粉末状；UV（MeOH，HPLC）λmax241、289、334、363 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）数据见表 2；ESIMSm/z：453[M+H]+。

Holyrine A（3）：淡黄色粉末状；UV（MeOH，HPLC）λmax240、288、333、360 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）、13C-NMR（CD3OD，150 MHz）数据见表 2；ESIMSm/z：441[M+H]+。

K252c（4）：淡黄色粉末状；UV（MeOH，HPLC）λmax240、288、333、360 nm；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）、13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）数据见表 2；ESIMSm/z：312[M+H]+。

2.4 生物活性

对化合物进行体外抗菌活性评价，结果表明，化合物 1 对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及白色念珠菌具有较弱的抗菌活性，最低抑菌浓度（MIC）值为 128 μg/ml；对铜绿假单胞菌ATCC27853、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌等没有明显的抑制活性，MIC 值 〉 256 μg/ml。

体外细胞毒活性结果（表 3）显示，其中用阿霉素作阳性对照，阴性对照未加化合物。化合物 1和 2 对宫颈癌 HeLa 细胞和结肠癌 HCT116 细胞均具有很强的细胞毒活性，IC50值均在纳摩尔水平（0.75 ～ 12.3 nmol/L），对乳腺癌 MCF-7 细胞的抑制活性较低，IC50约为 335 nmol/L。化合物 3对以上三种肿瘤细胞的抑制活性比 1 和 2 低约2 倍，表明 N12-C2' 键开环导致活性降低。化合物4 对以上肿瘤细胞的抑制活性比化合物 1 和 2低 25 ～ 2500 倍，表明糖基对吲哚咔唑类化合物的细胞毒活性具有重要的影响。

表2 化合物 1 ～ 4 的 NMR 数据*Table 2 The NMR spcetroscopic data for compounds 1 - 4*

表3 化合物 1 ～ 4 的体外细胞毒活性（IC50，nmol/L）Table 3 In vitro cytotoxic activity of compounds 1 - 4(IC50, nmol/L)

3 讨论

本研究通过基因组生物信息学分析，在菌株IMB3-202 基因组中发现一条吲哚咔唑生物合成基因簇，进而通过发酵条件优化，最终从中分离并鉴定了 4 个吲哚咔唑类化合物。本研究结果表明，通过基因组学分析，可以在基因水平上预测产物结构，有助于快速识别特定类型的产物，对于微生物天然产物的发现具有重要的指导意义。

[1] Nakano H, Omura S. Chemical biology of natural indolocarbazole products: 30 years since the discovery of staurosporine. J Antibiot(Tokyo), 2009, 62(1):17-26.

[2] Sánchez C, Méndez C, Salas JA. Indolocarbazole natural products:occurrence, biosynthesis, and biological activity. Nat Prod Rep, 2006,23(6):1007-1045.

[3] Shaaban KA, Elshahawi SI, Wang X, et al. Cytotoxic Indolocarbazoles from Actinomadura melliaura ATCC 39691. J Nat Prod, 2015, 78(7):1723-1729.

[4] Kim ES. Midostaurin: first global approval. Drugs, 2017, 77(11):1251-1259.

[5] Wang Q, Zhang Y, Wang M, et al. Neo-actinomycins A and B, natural actinomycins bearing the 5H-oxazolo[4,5-b]phenoxazine chromophore, from the marine-derived Streptomyces sp. IMB094. Sci Rep, 2017, 7 (1):3591.

[6] Tan Y, Hu Y, Wang Q, et al. Tetrocarcins N and O, glycosidic spirotetronates from a marine-derived Micromonospora sp. identified by PCR-based screening. RSC Adv, 2016, 6(94):91773-91778.

[7] Gan M, Liu B, Tan Y, et al. Saccharothrixones A-D,tetracenomycin-type polyketides from the marine-derived actinomycete Saccharothrix sp. 10-10. J Nat Prod, 2015, 78(9):2260- 2265.

[8] Wu C, Tan Y, Gan M, et al. Identification of elaiophylin derivatives from the marine-derived actinomycete Streptomyces sp. 7-145 Using PCR-Based Screening. J Nat Prod, 2013, 76(11):2153-2157.

[9] Schupp P, Eder C, Proksch P, et al. Staurosporine derivatives from the ascidian eudistoma toealensis and its predatory flatworm pseudoceros sp. J Nat Prod, 1999, 62(7):959-962.

[10] Meksuriyen D, Cordell GA. Biosynthesis of staurosporine, 1. 1H- and 13C-NMR assignments. J Nat Prod, 1988, 51(5):884-892.

[11] Hoehn P, Ghisalba O, Moerker T, et al. 3'-Demethoxy-3'-hydroxystaurosporine, a novel staurosporine analogue produced by a blocked mutant. J Antibiot (Tokyo), 1995, 48(4):300-305.

[12] Williams DE, Bernan VS, Ritacco FV, et al. Holyrines A and B,possible intermediates in staurosporine biosynthesis produced in culture by a marine actinomycete obtained from the North Atlantic Ocean. Tetrahedron Lett, 1999, 40(40):7171-7174.

[13] Yasuzawa T, Iida T, Yoshida M, et al. The structures of the novel protein kinase C inhibitors K-252a, b, c and d. J Antibiot (Tokyo),1986, 39(8):1072-1078.

[14] Kreitlow S, Mundt S, Lindequist U. Cyanobacteria--a potential source of new biologically active substances. J Biotechnol, 1999, 70(1-3):61-63.

[15] Koeth LM, DiFranco-Fisher JM, McCurdy S. A reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically. J Vis Exp, 2015, 103:e53028.

[16] Gan M, Zheng X, Gan L, et al. Streptothricin derivatives from Streptomyces sp. I08A 1776. J Nat Prod, 2011, 74(5):1142-1147.

[17] Weber T, Blin K, Duddela S, et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Res, 2015, 43(W1):W237-W243.

[18] Onaka H, Taniguchi S, Igarashi Y, et al. Cloning of the staurosporine biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0274 and its heterologous expression in Streptomyces lividans. J Antibiot (Tokyo),2002, 55(12):1063-1071.

[19] Sánchez C, Butovich IA, Braña AF, et al. The biosynthetic gene cluster for the antitumor rebeccamycin: characterization and generation of indolocarbazole derivatives. Chem Biol, 2002, 9(4):519-531.

[20] Ryan KS. Biosynthetic gene cluster for the cladoniamides, bis-indoles with a rearranged scaffold. PLoS One, 2011, 6(8):e23694.

[21] Kim SY, Park JS, Chae CS, et al. Genetic organization of the biosynthetic gene cluster for the indolocarbazole K-252a in Nonomuraea longicatena JCM 11136. Appl Microbiol Biotechnol,2007, 75(5):1119-1126.

[22] Chang FY, Ternei MA, Calle PY, et al. Targeted metagenomics:finding rare tryptophan dimer natural products in the environment.J Am Chem Soc, 2015, 137(18):6044-6052.

[23] Groom K, Bhattacharya A, Zechel DL. Rebeccamycin and staurosporine biosynthesis: insight into the mechanisms of the flavin-dependent monooxygenases RebC and StaC. Chembiochem,2011, 12(3):396-400.

[24] Salas AP, Zhu L, Sánchez C, et al. Deciphering the late steps in the biosynthesis of the anti-tumour indolocarbazole staurosporine: sugar donor substrate flexibility of the StaG glycosyltransferase. Mol Microbiol, 2005, 58(1):17-27.

[25] Omura S, Iwai Y, Hirano A, et al. A new alkaloid AM-2282 of Streptomyces origin. Taxonomy, fermentation, isolation and preliminary characterization. J Antibiot (Tokyo), 1977, 30(4):275-282.