经典孔隙结构钛合金内置物在兔肱骨近端大结节处骨长入的初步组织学研究

薛喆 宋关阳 李奉龙 姜春岩

采用传统人工肩关节假体置换治疗复杂肱骨近端骨折，术后大结节不愈合是最常见的并发症，严重影响肩关节功能，降低手术疗效［1］。目前临床应用的多孔涂层假体存在一定的缺陷，如低孔隙率、涂层与假体构架空间的界面剪切力以及原电池效应等，可影响骨长入、降低假体的生物固定强度。而通过电子束熔融技术制备的经典正六面体孔隙结构钛合金生物型内置物可以克服传统涂层假体的缺点，理论上可进一步改善骨长入效果。

本研究采用新西兰大耳兔进行动物实验，将经典孔隙结构即正六面体孔隙结构的钛合金生物型内置物植入大兔肱骨近端大结节处，旨在通过组织学切片研究证实：①随着时间的演变，经典孔隙结构的钛合金金属在肱骨近端是否具备骨长入潜能；②植入钛合金生物型内置物后随时间的演变骨长入的组织学特点如何。

本研究可为钛合金生物型内置物在肩关节外科领域的应用以及设计加强大结节愈合的骨折型人工肩关节假体提供理论和依据。

材料与方法

一、实验动物及分组

于2015年5月至2016年11月在本院动物实验室，将成年雄性新西兰大耳白兔15只随机分为3组，体质量2.41～2.70 kg，兔龄4个月，单笼普通饲料喂养，术前观察1周，确认体健无疾病。实验过程对动物的处置符合医学伦理学标准。

二、方法

兔肱骨近端生物型内置物植入模型的建立：以速眠新Ⅱ注射液0.2 ml/kg对实验动物进行肌肉注射以施行全身麻醉，麻醉成功后将其置于左侧卧位。术区备皮、清洁，常规消毒，铺无菌单。在肩关节做长约2 cm的纵行皮肤切口。钝性分离三角肌，显露大结节，见图1A。于大结节止点处，使用2.0克氏针，穿过肱骨干的中心，并与肱骨远端长轴成约120°钻入，将经典孔隙结构的钛合金螺钉（图2、3）沿骨道方向置入，建立肱骨近端钛合金生物型内置物植入模型，如图1B。检查无活动性出血后逐层关闭伤口。

图1 骨长入模型建立 图A钝性分离兔三角肌，显露大结节；图B将经典孔隙结构的钛合金螺钉与肱骨远端长轴成约120°打入骨质，建立肱骨近端钛合金生物型内置物植入模型

图2 经典结构钛合金内置物，以正六面体网格为基础单元向周围空间规律排布

图3 螺钉实物图（每刻度为1mm）

三、造模后处理

观察家兔自然苏醒，常规进食。始终置于兔笼（65 cm×40 cm×40 cm）中限制活动，患肢不制动，造模后前3 d，肌肉注射青霉素4×105 U预防感染。分别于术后3、6、12周这三个时间点随机选取实验兔进行样本标本采集。保留肱骨头至其远端3 cm的骨标本，去除所有肌肉以及软组织。使用中性福尔马林固定48 h，再使用梯度酒精（70%、80%、90%）脱水7 d，100%脱水2次，每次2 d。使用Technovit 7200VLC光固化树脂浸透1个月后，行光固化包埋。再应用德国EXAKT硬组织切磨系统制片（EXAKT 400 CS/AW Micro Grinding System），平行肱骨干长方向切割，以解剖轴为中心，内外侧分别留有约1mm骨组织，切成厚度大约为2mm的标本后，行甲苯胺蓝染色。后于光学显微镜下，采用×4倍放大率进行图像采集。骨长入面积的测量使用Image-Pro Plus软件进行图像的处理分析。在矢状位切片上做一个可包含螺钉长径a和宽径b的矩形，则总面积S0=a×b,在计算出此矩形去除螺钉后的总面积S1及可被甲苯胺蓝着色的组织面积Sx，定义骨长入面积S%=Sx/S1×100%（图4）。所有的组织学测量均由同一操作者完成。

图4 骨长入面积测量，此图为沿螺钉矢状位切割后的组织学切片，其中黑色为螺钉部分（右侧为螺母部分），紫色部分为长入螺钉空隙内的骨质。取可包含螺钉体部的矩形，最长径为a,最宽径为b（黄色示），则总面积S0=a×b,使用Image-Pro Plus软件计算出此矩形中去除螺钉后的总面积S1及可被甲苯胺蓝着色的组织面积Sx，则骨长入面积百分比S%=Sx/S1×100%

四、观察指标

①定性观察：观察随着时间的演变，生物型内置物骨长入的大体情况。②定量测量：骨长入面积百分比随时间的变化情况。

五、统计学分析

使用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，数据由均值±标准差表示，评估三个时间点下骨长入面积百分比的差异，采用ANOVA方差分析。P ＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、实验动物数量分析

15只兔术后健康状况良好，均于造模当天开始自主进食。观察期间无伤口感染及非预计性死亡发生。在建模操作过程中，家兔的肩关节局部解剖结构与人类相似，手术入路的相关解剖位置比较恒定，肩关节大结节生物型内置物植入模型的建立操作过程可重复性高。

二、生物型内置物骨长入情况随时间演变的大体变化情况

由镜下组织学切片染色大体来看，在3、6、12周这三个时间点，如图5所示，可见螺钉空隙内软骨细胞数量成正增长趋势，且分布的范围逐渐扩大。

三、骨长入百分比随时间的变化情况

15个样本的组织学测量结果如表1所示， 组织学数据显示在骨长入百分比方面三个时间点之间总体上差异有统计学意义,且12周时的骨长入面积百分比相比3周（P ＜0.05）和6周（P ＜0.05）都有显著性的增长； 但3周和6周这两个时间点骨长入面积百分比差异无统计学意义（P ＞0.05），如表2所示。

图5 不同时间点螺钉骨长入面积情况 图A、B、C分别为3、6、12周时骨长入螺钉孔隙的镜下情况。其中黑色为螺钉部分（右侧为螺母部分），紫色部分为长入螺钉空隙内的骨组织，可见螺钉空隙内软骨细胞数量成正增长趋势，且分布的范围逐渐扩大

表1 15个样本组织学测量结果

表2 三个时间点骨长入面积百分比情况（±s）

表2 三个时间点骨长入面积百分比情况（±s）

注：与6周比较，aP＞0.05；与12周比较，bP＜0.05；与12周比较，cP＜0.05

骨长入时间（周） 骨长入面积百分比（%）321.0±2.7ab 28.6±2.3c 12 40.0±9.76

同时制作出了骨长入面积百分比在三个时间点上的柱状图（图6）及随时间变化折线图（图7），并对骨长入面积百分比及相对应的时间进行函数拟合，发现在3个月内，骨长入随时间的变化成对数关系（图8），S%=13.706ln（T） + 5.3095；R2=0.9868

图6 3、6、12周时骨长入面积百分比比较情况

图7 骨长入面积百分比随时间变化折线图

图8 骨长入面积百分比与时间的函数关系

讨 论

本研究通过组织学证实，随着时间的推移经典孔隙结构钛合金生物型内置物在大兔肱骨近端的骨长入面积比例不断增加，且在12周内骨长入面积与时间成指数关系，增长速度逐渐变慢。

目前，钛合金金属假体作为新兴的骨长入材料，与之相关的基础及临床研究较为有限［1］，有关钛合金金属应用于肩关节假体的基础及临床研究在国内外亦属空白。而国内外有关钛合金内置物植入骨组织后骨长入随时间演变的组织学研究也未见报道。

经典孔隙结构的钛合金金属是以钛合金为原料，采用电子束熔融技术制备成的新型金属材料，其以六面体网格为基础单位向周围空间规律排布发散形成的几何结构。虽然已有研究证明此种空间构型骨长入的确实性［1］，但对于该种孔隙结构的钛合金金属植入骨组织后骨长入情况也无定论。因此设计实验进行研究。

肱骨近端骨折是肩关节外科的常见疾病，其中对于老年粉碎性Neer四部分骨折以及部分三部分骨折患者，老年解剖颈骨折患者，肱骨头劈裂、骨折脱位患者等情况，应采用肩关节置换术治疗［1-5］。虽然人工肩关节置换治疗肱骨近端骨折可以较好的缓解患者的疼痛，但对于术后肩关节功能恢复的文献报道结果不一致［1，6-7］。近年来大部分研究报道采用人工肩关节置换术治疗肱骨近端骨折术后患者疼痛满意度在80%左右［1］，但是患者术后肩关节活动度及功能恢复并不理想。目前学术界认为其影响因素主要包括：假体高度、后倾角、大结节位置、功能锻炼的时机选择等［8-11］，其中大结节的解剖愈合状况是位移被大多数学者一致认同，影响术后肩关节功能的重要因素［1］,因此，肩关节假体置换术后的大结节不愈合是肩关节置换术后的最常见并发症之一。

接受人工肩关节置换术的患者群主要特点为高龄、骨质疏松、骨折粉碎程度严重、骨折周围组织条件差、骨折缺血供应破坏严重［3］。大结节作为肱骨近端重要的解剖结构和功能单位，其与假体间的愈合状况必然是受到以上因素的影响，进而降低了人工肩关节置换的手术疗效。

关于影响大结节愈合的因素，目前文献报道的影响人工肩关节假体置换术后大结节愈合的主要因素包括患者年龄、性别、骨质状况、假体的置入位置、肩袖质量以及假体类型［1］，高龄、女性患者以及明显骨质疏松者术后大结节不愈合发生率明显增高。目前应用较多的假体类型是在原有假体构架基础上，于假体近端通过特殊工艺制备多孔涂层，进而促进固定于此处大结节与假体的骨长入，理论上改善术后大结节的愈合状况，但是相关的临床多中心回归分析研究发现大结节的愈合率仍不能达到满意的效果［1，12］。因此如何通过相关基础研究为改善假体设计进而提高术后大结节的愈合率提供必要的理论及实践依据是肩关节外科的重要课题。

对于行肩关节置换术的患者，绝大多数文献都认为术后康复是评价手术成功与否的关键因素之一［1，13］。在本研究中，发现在内置物植入早期（12周内），螺钉空隙内的软骨细胞在不断的增长，其长入面积以及范围在不断的扩大。组织学分析发现3周和6周的骨长入面积百分比差异无统计学意义，而3周与12周以及6周与12周相比差异均有明显的统计学意义，即12周相对于3周和6周骨质生长更加明显。且至少在12周内，骨质的生长与时间成指数关系，表明骨长入速度在术后早期为峰值，随时间的延长逐渐变慢，且经验性临床观察表明在术后10～12周时肌腱的愈合才足以支持早期的肌肉训练以及主动活动［14-15］。因此术后早期为骨质生长的重要时期，同样也是肩关节稳定性形成的关键时机，如过于激进的进行术后主动功能练习及肌肉训练，则会干扰大结节的愈合过程，甚至导致术后失效［16］。因此在术后的康复过程中，特别是内置物植入的早期（12周内）需要严格遵循术后康复流程，避免早期主动功能锻炼以及力量训练，为内植物与骨质之间的愈合提供良好的力学环境，降低术后并发症的发生率。

本研究还有以下几点不足：第一，入组的实验动物样本量较小，且饲养时间相对较短，缺少更长期的研究跟进。第二，缺少对照组，没有与传统空隙结构的生物型内置物的骨长入情况进行对比。第三，本研究只进行了组织学切片研究，没有相应的生物力学实验进行佐证，因此还需要后续的生物力学研究进一步证实经典孔隙结构钛合金生物型内置物的有效性及安全性。

综上所述，本研究通过组织学切片证实，随着时间的推移经典孔隙结构钛合金生物型内置物在大兔肱骨近端的骨长入面积比例不断增加。在12周内，骨长入面积与时间成指数关系，增长速度逐渐变慢。本研究结果提示在临床中需要更加严格得遵守肩关节置换术后主动功能锻炼的康复流程，降低术后并发症的发生。

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