基于聚乙烯亚胺构建pH响应性口服甲氨蝶呤纳米递送系统

蒙小丽 龙玲 陈小勇

[摘要]目的 构建pH响应性的口服甲氨蝶呤纳米递送系统，以提高甲氨蝶呤的口服生物利用度。方法 基于聚乙烯亚胺与甲氨蝶呤之间的多重非共价键作用力，采用透析法制备甲氨蝶呤纳米粒，观察测定其形貌、粒径、电位、载药性能等理化特征，并通过体内外药物释放实验初步评价该纳米粒系统的pH响应性及其口服生物利用度。结果 通过该法制备的甲氨蝶呤纳米粒的粒径均一、大小可控、表面带正电荷，具有优良的载药性能及明显的pH响应性释放行为。该纳米粒在pH=1.2的环境中不释放，而在pH=7.4的环境中可快速释放。相较于甲氨蝶呤原料药和片剂，甲氨蝶呤纳米粒口服后血药浓度达峰时间更短，峰浓度更高，并具有更大的药时曲线下面积。结论 该纳米粒可显著提高甲氨蝶呤的口服生物利用度，并有望基于此增强甲氨蝶呤口服抗肿瘤活性，具有较好的应用前景。

[关键词]纳米粒；甲氨蝶呤；聚乙烯亚胺；口服给药

[中图分类号] R944.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）2（a）-0020-05

[Abstrcact]Obiective To construct pH-responsive oral Methotrexate （MTX） nanoparticles based polyethylenimine （PEI） for improving the oral bioavailability of Methotrexate.Methods MTX nanoparticles were prepared by dialysis with MTX and PEI based on multiple non-covalent interactions between them.Physicochemical characteristics of nanoparticles containing morphology，particle size，zeta potential，drug loading，and entrapment efficiency were observed and determined，and in vivo and in vitro drug release profiles were employed to evaluate the pH responsive release ability and the oral bioavailability of MTX/PEI nanoparticles.Results The nanoparticles were successfully prepared as discrete and uniform spheres with positive charges，which exhibited an excellent MTX loading performance，and an obvious pH responsive release behavior that no released in pH=1.2 solvent，but rapidly released in pH=7.4 solvent.Compared with the raw MTX and tablet of MTX，MTX/PEI nanoparticles showed a shorter peak time and higher peak concentration after oral administration，and also a larger area undercurve （AUC）.Conclusion Oral bioavailability of MTX is significantly improved by MTX/PEI nanoparticle system.Based on this，the MTX/PEI nanoparticlesystem is expected to significantly enhance the oral MTX antitumor activity with a good prospect in application.

[Key words]Nanoparticles；Methotrexate；Polyethyleneimine；Oral administration

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是一種细胞毒性药物，被广泛应用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎、头颈部肿瘤、骨肿瘤等多种恶性肿瘤疾病的治疗[1]。作为叶酸类似物，MTX可通过抑制二氢叶酸还原酶，导致DNA的生物合成受阻，从而抑制肿瘤细胞的增殖，是其抗肿瘤的主要机制[1-5]。然而，由于上皮细胞的增殖较快，增殖周期较短（24～48 h），MTX在抗肿瘤增殖的同时，对上皮细胞的增殖同样具有较强的抑制作用[6]。尽管MTX口服制剂较注射剂具有更加安全、方便、患者依从性高的特点，特别是对于减少注射化疗药物带来的血管损伤具有十分积极的作用；然而，由于MTX对上皮细胞增殖的抑制，其与消化道上皮细胞的长时间接触会导致严重的消化道反应，易引起口腔炎、胃炎及消化道出血等，这是目前MTX口服应用的主要障碍[7-8]。近年来，研究者为提高MTX的口服生物利用度与口服安全性，已通过应用纳米制剂取得了部分进展，但由于传统纳米粒的载药性能较低，且无环境敏感性，对MTX口服生物利用度与安全性的提高仍十分有限[9-13]。

研究提示，聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）与吲哚美辛等羧基小分子药物可通过氢键、静电作用等多重非共价键作用力自组装形成具有高载药量的pH响应性口服纳米释药系统[14-16]。MTX为叶酸类似物，其与吲哚美辛相似，在化学结构中含两个羧基。显然，MTX同样有望与PEI之间通过静电作用、氢键作用等自组装形成具有pH响应性的高载药聚合物纳米粒。本研究拟利用PEI和MTX之间的多重非共价键作用力来构建具有高载药量的pH响应性的口服pH响应性纳米释药系统，并对其pH响应性药物释放行为与体内药动学进行初步研究，探讨其在MTX口服递送中的应用潜力。

1材料与方法

1.1材料

PEI（分子量为25 kDa，Sigma，美国），MTX（Sigma，美国，纯度≥99%）；MTX片（上海信谊药厂有限公司）；透析袋（截留分子量：3500 Da，北京经科宏达生物有限公司）；DMSO（分析纯，重庆科隆化工有限公司）；乙醇（分析纯，重庆科隆化工有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器

20A高效液相色譜仪（日本Shimadzu公司）；754型紫外分光光度计（上海丙林电子科技有限公司）；SXJQ-1型数显直流无级调速搅拌器（郑州长城科工贸公司）；HZP-150型恒温振荡培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；JEM-2100型透射电子显微镜（日本JEOL公司）；Nano-zs型激光粒度Zeta电位分析仪（美国Malvern公司）；BL3-120A超声清洗器（上海比郎仪器有限公司）。

1.3纳米粒的制备

称取一定量的MTX与PEI，溶于1 ml二甲基亚砜中，转移至透析袋中（MWCO=3500），透析袋放入水中透析，隔一定时间换取去离子水，透析24 h后，取出透析袋中溶液，冷冻干燥后即得MTX/PEI纳米粒。

1.4纳米粒的形态观察

采用透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒的形态。纳米粒粒径与Zeta电位通过激光粒度Zeta电位分析仪测定。

1.5 MTX的载药量及包封率测定

精密称取10 mg纳米粒冻干粉，采用乙醇溶解后，转移至10 ml容量瓶中定容，定容后溶液于紫外分光光度计306 nm处以乙醇为空白测定吸光度，代入标准曲线计算其浓度。分别按公式（1）与（2）计算纳米粒的载药量和包封率。

载药量（%）=组装体中所含药物量（mg）/组装体总量（mg）×100% （1）

包封率（%）=载药量（%）/理论载药量（%）×100% （2）

1.6纳米粒pH响应释放行为评价

按MTX与PEI按投药重量比20/10制备MTX/PEI纳米粒，透析后的溶液取0.5 ml转移至透析袋中，先将其放入40 ml pH 1.2的PBS释放介质中进行体外释放，每过一段时间从释放介质中取出4 ml，并补充4 ml新鲜释放介质。2 h后将40 ml释放介质全部取出，补充40 ml pH 7.4的PBS释放介质，定时取4 ml释放介质，并补充4 ml新鲜释放介质。称取一定量的MTX原料药，放入透析袋中，按上述方法进行pH响应释放行为的评价。不同时间点的药物浓度通过紫外分光光度计在306 nm的测定波长下测定，并根据标准曲线计算甲氨喋呤的累积释放量和累积释放百分比，计算后绘制释放曲线。

1.7纳米粒的体内药物释放动力学研究

SD雄性大鼠购置于第三军医大学动物实验中心，体重200～250 g，灌胃前24 h禁食，分为MTX原料药组、MTX片剂组和MTX/PEI纳米粒组，每组SD大鼠4只。按MTX含量10 mg/kg给予大鼠灌胃，其中纳米粒组中甲氨喋呤载药量为57.2%。口服灌胃给药后一定时间点取血，3000 r/min离心10 min后取血浆，加入茶碱内标溶液 50 μl，涡旋10 s，加乙腈1 ml，涡旋60 s，16 000 r/min离心10 min，吸取上清液1 ml置另一离心管中，60℃氮气吹干，残渣用流动相120 μl溶解，离心，上清液过滤后取20 μl进样。血药浓度的测定参照文献报道的高效液相色谱法测定[17]，流动相为磷酸盐缓冲液（pH=6.6）-甲醇（82∶18）；检测波长：306 nm 和254 nm；流速：1 ml/min；柱温：30℃。

1.8血药浓度曲线下面积的计算

采用DAS 3.0软件计算获得，计算结果采用PASW 18.0软件对两组数据以独立样本t检验方法进行均值比较。

2结果

2.1纳米粒的理化性能

图1为不同投药重量比下制备的MTX/PEI纳米粒在透射电镜下的形貌，可以看到MTX与PEI在5/10、10/10与20/10三个投药重量比下均可形成粒径均一、形态良好的球形纳米粒。

进一步采用激光粒度Zeta电位分析仪对纳米粒的粒径及表面电位进行测定，可以发现纳米粒的粒径大小与投药重量比成正比。随着MTX/PEI投药重量比的增加，纳米粒的粒径随之增大。其中，投药重量比5/10、10/10与20/10的MTX/PEI纳米粒的粒径分别为（124.1±0.402）nm、（133.5±1.732）nm与（178.7±0.400）nm（图2A）。不同投药重量比纳米粒的PDI值分别为0.214±0.071、0.231±0.059、0.205±0.081，提示不同投药重量比纳米粒的粒径分布均较为均一。对纳米粒的Zeta电位测定发现，不同投药重量比的纳米粒表面均带正电荷，提示在纳米粒的表面主要由阳离子聚合物PEI构成。同时，随着MTX/PEI投药重量比的增加，纳米粒的zeta电位则随之降低。MTX/PEI投药重量比5/10、10/10与20/10的MTX/PEI纳米粒的zeta电位分别为（68.2±6.00）mV、（63.3±1.4）mV与（58.2±1.06）mV（图2B），这主要是由于甲氨喋呤在纳米粒中所占比例增加，PEI的正电荷被MTX的负电荷中和更多。

2.2纳米粒的载药性能

纳米粒的载药量与包封率是评价纳米粒载药性能的重要指标，通过紫外分光光度计测定MTX/PEI纳米粒的载药量和包封率发现，MTX/PEI投药重量比在5/10～20/10的范围内时，纳米粒的载药量及包封率与其的投药重量比成正相关；当MTX/PEI投药重量比为20/10时，其载药量可高达到（56.3±7.49）%，包封率可达到（84.5±11.2）%（图3），具有优秀的载药性能。

2.3 MTX/PEI纳米粒的pH响应性释放行为

图4为MTX/PEI纳米粒在pH=1.2与pH=7.4介质环境下的累积药物释放曲线，MTX/PEI纳米粒在pH=1.2的释放介质中几乎不释放，当将其转移至pH=7.4的释放介质中时，在24 h内快速释放超过90%；而MTX原料药在pH=1.2释放介质中释放速度高于纳米粒，2 h内释放了20%左右的药物，而在pH=7.4中释放速度则显著的低于纳米粒，24 h内仅释放约70%的药物（图4）。

2.4 MTX/PEI纳米粒的体内释放行为

图5为MTX原料药、MTX片剂与MTX/PEI纳米粒经口服给药后在大鼠血浆中的药时曲线。如图所示，MTX/PEI纳米粒经口服后，较MTX原料药与MTX片剂的吸收速度大大提高，其达峰时间更短，在给药后160 min后即达到达峰浓度，其Cmax可达到（1.61±0.23）μg/ml，并在24 h均保持较高的血药浓度（>0.8 μg/ml）。而MTX原料药与MTX片剂在给药后220 min后分别达到达峰浓度，其Cmax分别为（0.85±0.13）μg/ml与（1.13±0.25）μg/ml。

随后，进一步采用DAS 3.0软件对MTX原料药、MTX片剂与MTX/PEI纳米粒的口服生物利用度进行计算，MTX/PEI纳米粒可显著提高MTX的生物利用度，其AUC值可达到（118.4±13.5）μg/（L·h），而MTX原料药与MTX片剂的AUC值则显著低于MTX/PEI纳米粒，分别为（37.9±5.66）μg/（L·h）与（65.4±3.91）μg/（L·h）（图6）。

3讨论

MTX是临床上广泛使用的小分子药物，适用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎等肿瘤治疗以及顽固性普通银屑病、系统性红斑狼疮、皮肌炎等自身免疫病。其作用机制主要为抑制二氢叶酸还原酶而达到阻碍肿瘤细胞DNA合成，从而抑制肿瘤细胞的生长与繁殖。甲氨喋呤为叶酸类似物，分子结构中含有2个羧基，为羧基小分子药物，其中的羧基可与PEI之间的氨基发生静电作用与氢键作用；同时MTX中的疏水基团则可与PEI的长碳链之间形成疏水作用，从而构成了MTX与PEI之间的多重非共价键作用力。

本研究基于甲氨喋呤与PEI之间的多重非共价键作用力，成功制备了MTX/PEI纳米粒。通过透射电镜观察，可以看到该纳米粒形态良好，为非常均匀的球形颗粒，粒径约为100 nm。通过激光粒度Zeta电位分析仪测定的粒径分布结果与透射电镜观察结果相似，不同MTX/PEI投量重量比的纳米粒其粒径分布在70～100 nm，并且可通过投量重量比的调节来实现纳米粒粒径的可控。由于PEI为阳离子聚合物，该纳米粒表面带正电荷。研究提示，肠道黏膜表面携带负电荷，表面带正电荷的纳米粒更易黏附于肠道黏膜，增加肠道对纳米粒的摄取，因此，MTX/PEI纳米粒的表面正电荷性质有望帮助纳米粒在口服给药后黏附于肠道表面，从而增加肠道保留时间，提高药物的吸收。传统的纳米粒通常基于单一的弱疏水作用力组成，需要较多的聚合物组成来负载药物，因此其载药量通常较低[5，9-10]。MTX/PEI纳米粒通过氢键、静电作用等多重非共价键作用力组成，本研究结果显示，其载药量相对于传统的MTX纳米粒的载药量有大幅提升，随着投药量的增加，载药量呈上升趋势，最高可达55%以上，包封率可达到85%以上，提示MTX与PEI通过多重非共价键相互作用构建的纳米粒具有优秀的药物负载能力。

最后，本研究对MTX纳米粒的体外释药特性和体内药动学进行了初步探讨。MTX的解离常数pKa=3.4、pH=1.2时MTX中的羧基处于质子化水平，药物与聚合物间强的非共价键相互作用力仍然存在，因此，MTX/PEI纳米粒在pH=1.2的释放介质中几乎不释放。当纳米粒处于pH=7.4的释放介质中时，MTX中的羧基处于解离状态，破坏了药物与聚合物间的氢键，导致了纳米粒的解缔合，MTX从而在pH=7.4的释放介质中能够快速释放，在24 h内释放即超过90%。随后的体内药动实验显示，MTX/PEI纳米粒其pH响应性的药物释放行为可减少药物在胃酸中的释放，增加药物在肠道中的释放，从而相较MTX原料药和MTX片剂显著提高MTX的口服生物利用度[18]。另外，MTX/PEI纳米粒生物利用度提高的机制还有可能是因其表面带有正电荷，可吸附于带负电荷的小肠黏膜层，从而使载药组装体较长时间停留在小肠，增加了肠道保留时间，进而促进了MTX的口服生物利用度[19]；同时，MTX/PEI纳米粒灌胃后在小肠内部分经肠内吞作用吸收进入全身循环，促进了MTX的吸收[20]。

综上所述，MTX/PEI纳米粒可通过其pH响应性释放行为及肠道黏附能力，大幅提高MTX的口服生物利用度，有望增强MTX的口服抗肿瘤活性。同时，该纳米粒具有优良的载药性能，相较于传统纳米粒具有一定应用优势，且制备工艺简单、粒径均一、大小可控，为提高MTX的口服抗肿瘤活性奠定了应用基础，有较好的应用前景。

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