植物黄酮醇提取方法研究进展

方 芳,王凤忠

(中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)

黄酮醇是广泛存在于自然界中的一类重要的次生代谢产物,属于植物类黄酮[1]。大量研究表明,黄酮醇作为自然界中重要的辅色物质,不仅与植物色泽的形成密切相关[2-3],同时作为重要的抗氧化剂,还具有重要的生理及保健功能,对包括癌症、肥胖、肿瘤、心脑血管疾病及老年痴呆等的多种慢性疾病及老年疾病均具有重要的预防和治疗作用[1,4-7]。因此,黄酮醇类化合物作为天然色素及功能活性因子目前在食品、保健品、医药及化妆品领域均有广泛应用[8]。

黄酮醇具有类黄酮类化合物典型的C6-C3-C6骨架,与其它多酚类化合物类似,其在植物细胞中多以结合态形式存在于细胞壁中,而极少数以游离态形式存在于细胞液泡中[9-11]。因此如何确保黄酮醇类化合物得到有效释放,有效获取植物细胞中的黄酮醇类化合物成为决定其工业应用的重要制约因素。而提取技术作为从植物原料中获取生物活性物质的第一步和最重要的技术环节之一,了解其研究及应用进展对于有效获取植物黄酮醇具有重要意义[12]。本文就植物原料中黄酮醇类物质的提取方法研究进展进行综述,旨在为黄酮醇类物质分离提取及应用研究提供理论依据及技术支持。

1 不同方法在植物黄酮醇提取中的应用

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法虽在植物黄酮醇的提取过程中应用较多,但其有机溶剂残留问题成为困扰业界的一大难题,因此开发绿色、无毒的新型替代性提取溶剂,同时兼顾提取时间短、溶剂用量少、可有效保护提取物风味及活性、对目标物质溶解性进行有效改善等特点的方法[21]成为溶剂提取法发展的必然趋势。Parmar等通过响应面法研究β环糊精水溶液对苹果渣黄酮醇的提取效果时发现,当β-环糊精溶液浓度为2.8 g/100 mL,提取温度为45 ℃,提取时间为25.6 h时黄酮醇的提取效率最高,且提取效果与传统有机溶剂提取法相近,由此推测β-环糊精可作为提取植物多酚类化合物的环境友好型替代方法[21]。

传统溶剂提取法虽在植物黄酮醇的提取过程中被广泛应用,但因其存在提取耗时长、提取效率低、提取能耗大、有机溶剂残留、目标提取物易降解、所得产物在分析及应用前需进一步纯化等弊端,导致其应用和发展受到极大限制,因此开发高效替代型提取方法势在必行[22-25]。目前,应用较多的提取方法包括超声辅助提取法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法、亚临界水提取法等。

1.2 超声辅助提取法

超声辅助提取法是从植物原料中提取酚类物质常用的一种方法。其是在溶剂提取的基础上,利用频率在20 kHz以上的超声波产生的能量对物料中的目标物质进行提取的一种方法。较之其它提取方法,因其具有提取效率高、操作简单、成本低廉、技术可靠等优点而在植物黄酮醇类物质提取中得到广泛应用[26-28]。Jang等以提取溶液浓度、提取温度、溶液pH、液料比及提取时间为因素,采用超声辅助提取法对洋葱固体废弃物中的槲皮素进行提取,发现在各因素中,提取溶液浓度及提取温度是影响提取得率的主要因素,而溶液pH、液料比及提取时间对提取率无显著影响。实验优化所得的最佳提取条件为溶液浓度59%,提取温度49 ℃,此时所得槲皮素的含量为11.08 mg/g DW[29]。Kumar等采用超声辅助提取法对洋葱(AlliumcepaL.)中的槲皮素进行提取,发现当超声时间为40 min,溶液pH为6.25时,槲皮素的提取效果最好,得率可达175.19 mg/100 g FW[30]。González-Centeno等以超声辅助提取法对葡萄皮渣中的总黄酮醇进行提取,通过响应面法研究超声频率、功率密度及提取时间对总黄酮醇提取效果的影响,发现当超声频率为40 kHz,功率密度为150 W/L,提取时间为25 min时提取效果最好[31]。Oniszczuk和Podgórski在对比研究不同提取方法对欧洲椴树花序的芦丁、槲皮素等黄酮醇类物质的提取效果时发现,超声辅助提取、加速溶剂萃取、微波辅助提取、索氏提取、热回流提取及固相萃取等不同提取方法对目标化合物的提取量具有明显差异,其中超声辅助提取法的提取效率最高[32]。Soares等以巴西药用植物(SiparunaguianensisAublet)叶子为对象,脱脂处理后分别以甲醇、乙醇、70%乙醇溶液及蒸馏水为提取溶液,通过连续超声辅助提取法对其黄酮醇类化合物进行提取,发现较之甲醇和蒸馏水,乙醇及70%乙醇溶液对黄酮醇的提取效果最佳,提取物得率分别为(99.73±0.64) mg RE/g和(77.31±0.33) mg RE/g。推测植物原料经脱脂处理后,连续超声辅助提取法可作为黄酮醇类物质提取的有效方法[33]。由此可见,应用超声辅助提取法对黄酮醇类物质进行提取目前已在多种果蔬及药用植物原料中得到应用。针对特定植物原料,超声辅助提取较之其它提取方法具有提取效率高、提取成本低等优点,分析其原因,一方面超声处理过程中所产生的超声波会引起空化效应,而空化效应会造成植物细胞壁发生破裂、胞内物质粒径变小,从而导致目标物质可透过细胞膜发生大量转运[32,34-35],另一方面,超声振荡可加速溶剂迅速进入物料内部,溶剂与目标物质的接触几率加大可导致目标物质迅速溶出[36]。但其提取效率及目标产物的得率与所采用的提取溶剂的种类、极性及提取温度等密切相关[27,33]。

1.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法是在溶剂提取法基础上发展起来的利用微波能对目标物质进行提取的一种新兴提取方法[37]。因其与传统溶剂提取法相比具有提取成本低、提取效率高、更加环保等优点,目前已被应用于食品、药品及化妆品等多个领域,在植物多酚及黄酮类物质的提取中得到广泛应用[38-39]。Yao等以布朗斯特酸性离子液体为溶剂,对银杏叶黄酮醇配糖体进行微波辅助提取,发现当离子浓度为1.5 M,微波辐射能为120 W,辐射时间为15 min,料液比为1∶30时,银杏叶黄酮醇的提取效果最好,与中国药典、欧洲药典及美国药典所提供的传统提取方法相比,提取时间明显缩短,提取效率明显提高,且前处理方法相对简单[22]。郭建敏等通过对比研究微波辅助提取法和水浴提取法对赶黄草中的槲皮素的提取效果发现,微波辅助提取法较之水浴提取法具有提取时间短(传统方法需要至少2 h以上,本方法仅需15 min)、提取效率高、提取质量好等明显优势,且当微波功率为255 W,微波时间为20 min,料液比为1∶10时,槲皮素的提取得率最高[40]。Kumar等采用微波辅助提取法对洋葱(AlliumcepaL.)中的槲皮素进行提取,发现当微波时间为150 s,溶液pH为6.25时,槲皮素的提取得率最高,且其提取效果明显优于超声辅助提取法[30]。Li等在研究均质-微波辅助提取法对黑加仑果渣黄酮醇的提取效果时发现,当乙醇浓度为60%,均质时间为3 min,液料比为28.3 mL/g,抗氧化剂用量为0.3%,提取环境pH为2.5,微波功率为551 W,微波时间为16.4 min时,黄酮醇的提取得率最高,且提取时间较传统溶剂提取法明显缩短,推测均质-微波辅助提取法可作为提取植物黄酮醇类天然产物的潜在方法[41]。孙雪等采用响应面法对香菇柄槲皮素的微波辅助提取工艺条件进行优化,确定料液比、微波功率及微波时间为影响香菇柄中槲皮素提取得率的主要因素,当料液比为30∶1,微波功率为385 W,微波时间为50 s时,槲皮素的提取得率最高,证明微波辅助提取法对提取香菇柄槲皮素是可行的[42]。由此可见,微波辅助提取法作为传统溶剂提取法的重要替代方法之一,目前已在中草药、食品原料及其废弃物的黄酮醇类物质提取中得到探索性应用。尽管提取对象不同,微波辅助提取法的工艺参数存在一定差异,但总体而言,与传统溶剂提取法相比,其具有提取时间短、溶剂用量低、目标物质提取得率高等特点。针对特定提取对象,其提取效果甚至优于超声辅助提取方法。分析其原因,一方面高频微波能可导致物料及溶剂中的偶极分子发生离子传导及偶极旋转,从而诱发物料内部瞬时升温,弱氢键发生断裂,造成离子迁移,进而加速溶剂分子的渗入;另一方面,微波又可对物料基质进行有效穿透,通过与物料内部的极性分子发生反应,引起胞内压力迅速增加,导致细胞壁发生破裂,活性物质迅速流出。因此与传统溶剂提取法相比,微波辅助提取法可有效缩短提取时间,提高提取效率[43-44]。

1.4 酶解辅助提取法

酶解辅助提取法是近年来新兴的一种提取方法,是在传统溶剂提取法的基础上,利用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等生物酶对提取对象的细胞壁结构进行破坏,一方面降低溶剂的传质阻力,一方面使细胞内容物充分暴露,从而加速细胞内有效成分释放的一种提取方法。因该方法具有提取效率高、反应条件温和且容易控制、可有效提高生物活性物质的提取得率等特点而引起业界广泛关注[45-48]。近年来其在黄酮醇类生物活性物质的提取中也得到探索性应用。Nguyen等分别采用复合植物水解酶Viscozyme L和α淀粉酶对花椰菜叶片黄酮进行酶法辅助提取,发现当提取温度为35 ℃,溶液pH为4.0,复合植物水解酶和α淀粉酶与底物的用量比分别为0.2%和0.5%时,提取效果最好,主要提取物为山奈酚糖苷类化合物及其羟基苯丙烯酸衍生物,与对照相比,采用复合植物水解酶和α淀粉酶混合物进行辅助提取可显著提高花椰菜叶片山奈酚糖苷等黄酮醇类化合物的得率[11]。张伟等采用纤维素酶对银杏叶中黄酮类物质进行辅助提取,发现当酶用量为0.3 mg/mL,酶解温度为45 ℃,溶液pH为4.0,酶解时间为2 h时,银杏叶中总黄酮的得率最高,较之对照组总黄酮得率提高了45.83%,且提取物中的黄酮类物质主要是槲皮素、山奈酚及异鼠李素等黄酮醇类物质[49]。

酶解辅助提取法除在植物原料总黄酮醇类物质的提取中得到应用外,也在单一黄酮醇的提取上得到一定应用,目前应用较多的为植物原料中槲皮素的高效提取。韩建军等采用响应面法对地锦草中槲皮素的酶解辅助提取方法进行优化,发现当提取时间为45 min,溶液pH为4.5,酶解温度为50 ℃,纤维素酶用量为0.6%时,槲皮素的提取得率与理论预测值最为接近,可达1.87 mg/g,从而证明纤维素酶可作为从地锦草中提取槲皮素等黄酮醇类化合物的重要辅助手段[50]。田佳琦等以玉米须为研究对象,采用纤维素酶-超声辅助提取方法对其槲皮素进行提取并对其提取方法进行优化,发现当纤维素酶用量为0.014 mg,乙醇浓度为50%(V/V)、料液比为25∶1,超声功率为200 W,超声时间为40 min时,槲皮素的得率最高,证明采用纤维素酶-超声辅助提取法对玉米须中的槲皮素进行提取是可行的[51]。施伟梅等采用响应面法对酶解辅助提取紫花苜蓿中槲皮素的工艺参数进行优化,发现当提取溶液浓度为22%,酶解时间为92 min,料液比为1∶40时,槲皮素的提取量最大,可达12.56 μg/g,证明酶解辅助提取方法可作为提取紫花苜蓿槲皮素的一种简单高效的提取方法[48]。由此可见,酶解辅助提取法作为一种新兴的生物活性物质提取方法,其适用范围广、提取效率高、操作简单,不仅适用于总黄酮醇类物质的提取,同时可用于单体黄酮醇的高效提取,目前已在多种植物原料中得以验证,且其提取效率较之传统溶剂提取法明显提高。分析其原因可能是由于酶解辅助提取法不仅可对植物细胞壁进行有效降解,破坏其细胞壁结构,从而使胞内物质得以更好地释放提高提取效率,同时各种生物酶还可促使目标化合物发生转糖基反应,提高目标化合物的可溶性,从而实现提高提取效率的目的[52-54]。

1.5 亚临界水提取法

亚临界水提取法,又称高压热水提取法或超加热水提取法,是以温度介于沸点(100 ℃)和临界点(374 ℃)间的水为提取溶剂的一种新兴的提取方法,因其在提取过程中无需引入有机溶剂,又被认为是新兴“绿色”提取方法[25,55]。亚临界水提取法依据在适当压力下通过提高水温可有效降低水的表面张力和粘性的原理,使亚临界水获得类似有机溶剂的极性,从而达到对物料中目标物质有效提取的目的[56-57]。由于与其它提取方法相比,亚临界水提取法具有提取效率高、提取效果好、安全无毒、无污染等特点而在食品及医药领域广受欢迎。黄酮醇作为与人体健康密切相关的一类生物活性物质,亚临界水提取法在其分离提取过程中得到广泛应用。Ko 等采用亚临界水提取法对洋葱皮中的槲皮素进行提取,发现当提取温度为165 ℃,提取时间为15 min,洋葱皮与硅藻土的混合比例为1.5∶2.5时,槲皮素提取量最高,可达16.29 mg/g。同时通过与传统溶剂法对比发现,亚临界水提取法对洋葱皮中的槲皮素提取率明显优于其它方法,其提取率分别较乙醇提取法、甲醇提取法及沸水提取法高出8倍、6倍和4倍。从而推测亚临界水提取法可作为传统溶剂提取法的有效替代方法[58]。Lekar等同样通过亚临界水提取法对洋葱皮中的槲皮素进行提取,发现经120 ℃亚临界水提取60 min可实现对洋葱皮中槲皮素的有效提取。亚临界水提取法对洋葱皮槲皮素的提取效力与传统溶剂提取法相当,但其提取时间较之传统溶剂提取法缩短了3～4倍,且提取成本低,可有效避免有机溶剂残留问题[59]。次年,Lekar等又采用亚临界水提取法对水辣蓼(PolygonumHydropiperL.)中的槲皮素进行提取,发现当提取温度为250 ℃,提取时间为30 min时,亚临界水提取法的槲皮素提取量为传统溶剂提取法的7.6倍,进一步证明亚临界水提取法是从植物原料中提取槲皮素等黄酮醇类化合物的可行方法[56]。Khoza等以苦瓜为对象,通过亚临界水提取法对其黄酮醇类物质进行提取,并通过UHPLC-Qtof-MS对提取效果进行检测,发现当提取温度介于150～250 ℃时,是黄酮醇类物质提取的最佳条件,提取所得槲皮素、山奈酚、异鼠李素及其相应衍生物多达15种[60]。Cheigh等分别以红茶、芹菜和人参为对象,以提取温度、提取时间及提取压力为影响因素,对比研究亚临界水提取法、热水提取法及甲醇、乙醇等有机溶剂提取法对其黄酮醇类物质的提取效果,发现在4种提取方法中,亚临界水提取法的提取效率明显高于热水提取法及有机溶剂提取法,亚临界水提取法所得杨梅酮、槲皮素及山奈酚等黄酮醇类物质的得率分别比乙醇提取法和甲醇提取法高出2.0～22.7倍和1.8～23.6倍。由此可见,亚临界水提取法不仅提取效率高、提取效果好、无有机溶剂残留、可实现对目标提取物的最大挖掘,同时其提取时间短、反应敏感,通过对不同物料的提取证明未来其可作为有机溶剂提取法提取植物原料中黄酮醇类物质的有效替代方法[61]。亚临界水提取法之所以可以实现对植物原料中黄酮醇类物质的高效提取,可能是由于当水温达到预定值,水处于亚临界状态时,一方面植物原料中结合态的黄酮醇类物质被有效释放,另一方面黄酮醇糖苷类结合物可能发生了水解反应,从而导致游离态黄酮醇类化合物的含量增加所致[56]。

1.6 其它提取方法

除上述提取方法外,近年来一些新兴的提取方法也在植物黄酮醇的提取过程中得到探索性应用。Li等以黄蜀葵花为原料,以提取温度、提取压力及提取溶液浓度为因素,采用改良的超临界二氧化碳提取法对其黄酮醇等类黄酮类化合物进行提取,发现在提取温度为52 ℃,提取压力为20 MPa,乙醇溶液浓度为85%时,黄酮醇的提取得率最高[62]。Xu等以超微壳聚糖为吸附剂,采用分散微固相萃取技术对槐花茶中的黄酮醇类化合物进行分离提取,发现当壳聚糖吸附剂的浓度为0.4 μg/mL,pH为7.0,提取时间为1.0 min,洗脱溶剂甲醇用量为100 μL时,提取方法的线性最佳,证明分散微固相萃取技术为提取槐花茶黄酮醇类化合物的有效方法[63]。Pakade等采用分子印迹聚合物固相萃取法对加热回流制得的辣木甲醇提取物中的黄酮醇糖苷配基进行再提取,并通过HPLC对所得黄酮醇提取物进行定性定量分析,发现该提取方法对辣木叶和花的甲醇提取物中的槲皮素及山奈酚的回收率可分别达到77%～85%和75%～86%,证明分子印迹聚合物固相萃取法可作为从加热回流法所得复杂提取物中进一步提纯黄酮醇提取物的可行方法[64]。由此可见,包括超临界二氧化碳提取法、分散微固相萃取法及分子印迹聚合物固相萃取法等在内的多种新兴提取方法均可用于植物黄酮醇提取的替代性方法。其中,超临界二氧化碳提取法作为一种高效、低成本、无有机溶剂残留的“绿色”提取方法,因其极性较低,常被用于非极性化合物提取,且通过添加辅助溶剂,还可实现对植物黄酮醇等极性化合物的有效提取[62]。分散微固相萃取法及分子印迹聚合物固相萃取法作为简单、高效、灵敏度高、溶剂用量少、提取时间短的提取方法,是传统固相萃取法的有效改良[63],利用化合物在固定相和流动相中进行选择性分布的特性,可通过对作为固定相的吸附剂的组成及性质进行优化来实现对目标化合物的有效提取[12]。

2 问题与展望

随着经济的发展和人们生活水平的提高,国民的营养健康意识日益增强,对与人体健康密切相关的营养及生物活性物质的需求日益旺盛。黄酮醇作为与人类多种慢性疾病的预防和治疗密切相关的一类营养功能因子,在食品、保健品、医药及日化产业中均得到广泛关注。因此如何从植物原料中有效提取黄酮醇则显得尤为重要。提取技术作为从自然界中获取目标物质的第一步,其决定着目标物质的得率和后续研究及应用工作能否顺利开展,近年来包括溶剂提取、超声辅助提取、微波辅助提取、酶解辅助提取、亚临界水提取等多种提取方法已在植物黄酮醇的提取过程中得到一定应用,但相关研究工作缺乏连贯性和系统性,同时所采用的提取方法存在一定局限性,缺乏创新性。

针对上述问题,未来在植物黄酮醇提取方法的研究中,应注意加强工作的连贯性、系统性和创新性。在对传统提取方法的工艺参数进行优化的过程中,应注意与新兴实验设计方法相结合,加强对多实验因素的综合考察,打破仅对提取时间、提取温度、料液比等常规因素的考察。在提取方法的选择上,则应尽可能多的探索新兴、绿色提取方法在植物黄酮醇提取领域的应用。

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