红枣白兰地中香气成分的顶空固相微萃取条件优化

任晓宇,张少云,裴晓静,谢立娜,杜文博,锁 然

(河北农业大学食品科技学院,河北保定 071000)

红枣是鼠李科植物枣树的果实[1],属于药食同源性食物,不仅营养丰富而且具有较高的药用价值[2-4]。红枣白兰地是以红枣为原料,经过发酵、蒸馏、橡木桶贮藏陈酿而成,最终的酒精含量为40%～80%[5]。它在制作过程中不经过任何的勾兑,大多数是家庭式作坊酿制出来的纯酒,并且在制作过程中产生了丰富而且复杂的香气物质。

香气成分是影响酒品质的一个重要因素[6-7],它主要受一些芳香化合物的影响。目前对于香气成分的提取方法主要有:溶剂萃取法、固相萃取法、固相微萃取法、搅拌子吸附萃取法、蒸汽蒸馏法、分馏技术等[8-9]。由于固相微萃取法(SPME)样品用量少、操作方便等,现已被广泛用于食品的风味物质研究[10-13]。目前对于香气成分的分析方法主要包括:气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、气相色谱-嗅闻(GC-olfactometry,GC-O)和电子鼻分析等。目前关于红枣白兰地香气成分的研究也有一些报道。彭松[14]采用HS-SPME研究了不同厂家生产的不同酒龄的红枣白兰地中的香气成分,共检测出了47种化合物,包括酯类、醇类、醛类、芳香类等,其中酯类物质含量最高。夏亚男[15]采用HS-SPME法与GC-MS相结合的方法研究了红枣白兰地中的香气成分,共检测到85种香气成分,其中酯类占总体香气成分的87.90%。李树萍[16]采用直接进样法,通过GC-O-MS技术对红枣白兰地中的风味物质进行分析,共检测出56种化合物,其中鉴定结构的有52种,占红枣白兰地总风味成分的99.72%,其中嗅闻确定的香气物质共16种。

本文采用HS-SPME与GC-MS、GC-O相结合的方法来研究红枣白兰地中的香气成分。由于HS-SPME的实验条件的变化对实验结果有很大影响,如:萃取温度:红枣白兰地中挥发性成分的种类、性质不同,温度对其萃取影响很大;萃取时间:过长或过短的萃取时间对化合物的测定含量有一定的影响;乙醇含量:乙醇含量的高低直接影响香气化合物的吸附能力;NaCl添加量:添加NaCl是为了降低香气化合物在溶液中的溶解度,促进其挥发;解析时间:香气化合物的解析程度与解析时间相关,解析不充分一方面会影响实验结果,另一方面会污染萃取头对下次实验造成影响。因此本实验对萃取温度、萃取时间、乙醇含量、NaCl添加量、解析时间5个萃取条件进行正交实验优化,确定最佳的固相微萃取条件,为红枣白兰地中的特征风味物质研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红枣白兰地(2009年3月新产原酒,常温保存,酒精度为47.3%) 河北保定阜平;水 符合GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》要求;氯化钠 天津市凯通化学试剂有限公司。

JJ200型电子天平 常熟市双杰测试仪器厂;PDMS/CAR/DVB萃取头、萃取手柄 美国 Supelco 公司;GC7890B-MS5977气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司;HP-INNOWAX(60 m×0.25 mm×0.25μm)美国安捷伦公司;数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红枣白兰地中香气物质的萃取 采用HS-SPME对红枣白兰地中的香气成分进行萃取。取7.5 mL稀释至一定乙醇含量的酒样,装入15 mL 带有聚四氟乙烯密封的顶空瓶中,加入一定量的NaCl,密封,在电子恒温水浴锅中加热,在一定温度下平衡15 min后,将已经活化好的DVB/CAR/PDMS萃取头插入样品瓶中的顶空部分,吸附一定时间。萃取完成后将萃取头插入气相色谱进样口解析一定时间后,供GC-MS分析,重复3次。

1.2.2 红枣白兰地中香气物质的分离和检测 采用GC-MS对香气物质进行分离和检测。将萃取头插入GC进样口,解析一定时间。气相色谱条件:以He为载气(纯度为99.999%),流速1.45 mL/min;进样口温度:250 ℃;柱温箱升温程序:50 ℃ 保持2 min,以6 ℃/min升温至230 ℃,并保持15 min;不分流进样。质谱条件:电离方式为EI,电离能量为70 eV;离子源温度:230 ℃;四级杆的温度:150 ℃;扫描范围:30～450 amu;谱库:NIST 14。嗅闻条件:ODP3嗅闻仪的传输线温度为250 ℃,补充气体是N2,接口温度为200 ℃。

1.2.3 红枣白兰地中香气物质的定性及定量 通过与NIST 14谱库进行对比分析,并且选择匹配度大于80的物质;另外,通过GC-O香气描述[17]进行分析,并同时参考文献[18-19]与相关资料进行比对,最终确定香气物质,化合物相对百分含量按峰面积归一化计算。

1.2.4 优化实验

1.2.4.1 单因素实验 以色谱分离所得到的峰个数和总峰面积为主要考察指标,对萃取条件进行单因素实验。固定萃取时间40 min、乙醇含量10%、NaCl添加量1.0 g、平衡时间15 min、解析时间6 min,考察不同萃取温度(35、40、45、50、55 ℃)对萃取效果的影响;固定萃取温度40 ℃、乙醇含量10%、NaCl添加量1.0 g、平衡时间15 min、解析时间6 min,考察不同萃取时间(20、30、40、50、60 min)对萃取效果的影响;固定萃取温度40 ℃、萃取时间40 min、NaCl添加量1.0 g、平衡时间15 min、解析时间6 min,考察不同乙醇含量(8%、10%、12%、14%、16%、18%)对萃取效果的影响;固定萃取温度40 ℃、萃取时间40 min、乙醇含量10%、平衡时间15 min、解析时间6 min,考察不同NaCl添加量(0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 g)对萃取效果的影响;固定萃取温度40 ℃、萃取时间40 min、乙醇含量10%、NaCl添加量1.0 g、平衡时间15 min,考察不同解析时间(2、4、6、8、10、12 min)对萃取效果的影响。

1.2.4.2 正交实验 在单因素实验的基础上,固定解析时间为6 min,对萃取时间、萃取温度、乙醇含量、NaCl的添加量进行4因素3水平L9(34)正交优化实验,如表1所示。

表1 萃取条件优化正交实验表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array experiments on extraction conditions

1.3 数据分析

按照1.2实验方法进行实验,每个实验重复3次,对所得到的相应的色谱图进行分析,计算其峰个数和总峰面积,上述数据用Origin软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 萃取条件优化

2.1.1 萃取温度对萃取效果的影响 由图1可以看出,随着萃取温度的升高,检测到的香气物质的总峰面积和香气物质的种类总数也不断增加,当达到40 ℃时总峰面积和峰个数都趋于稳定。当温度高于40 ℃时有利于香气物质的挥发,但温度过高也会使一些低沸点物质从萃取头上解析下来[20]。因此综合考虑正交实验选择40～50 ℃范围较合适。

图1 萃取温度对萃取效果的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the identification of volatile compounds

2.1.2 萃取时间对萃取效果的影响 由图2所知,随着萃取时间的增加,香气物质的总峰面积和峰个数呈现先增加后降低的趋势。萃取能够达到的平衡时间受许多因素影响,如:分配系数、扩散速度、萃取头膜厚度等[21]。在其它条件不变的情况下,固相微萃取纤维头在顶空瓶中达到吸附与解吸的动态平衡时有最大的吸附量。萃取时间过长,一些大分子物质的浓度将会增加使得小分子物质的浓度降低,最终导致峰面积以及峰个数降低[22]。过长的萃取时间会增加组分化学反应的可能,减少固萃取纤维的寿命[23]。当萃取40 min时总峰面积和峰个数达到最高,随后又逐渐降低。因此正交实验选择在30～50 min时间范围内进行萃取比较合适。

图2 萃取时间对萃取效果的影响Fig.2 Effect of extraction time on the identification of volatile compounds

2.1.3 乙醇含量对萃取效果的影响 由图3可知,随着乙醇含量的升高,总峰面积和峰个数也逐渐增加,当达到10%时趋于平缓,但乙醇含量超过14%时,萃取效果明显下降,总峰面积和峰个数都呈下降趋势。乙醇是红枣白兰地中的主要化学成分,乙醇含量过高时,长链脂肪酸酯的顶空浓度会受到影响[24],从而导致吸附能力减弱。由此可知,乙醇含量对红枣白兰地中的香气物质的萃取具有一定的影响。因此正交实验选择在8%～12%乙醇含量范围内进行萃取比较合适。

图3 乙醇含量对萃取效果的影响Fig.3 Effect of alcohol concentration on the identification of volatile compounds

2.1.4 NaCl的添加量对萃取效果的影响 NaCl的添加是为了降低香气成分在溶液中的溶解度,促进香气成分的挥发[15]。由图4可知,随着添加量的增加,总峰面积也增加,当达到1.4 g时达到最高值,随后又降低。但是NaCl的添加量对峰个数并没有较大的影响,都趋于平稳并保持峰个数在70～75。因此正交实验选择1.0～1.8 g范围较合适。

图4 NaCl添加量对萃取效果的影响Fig.4 Effect of NaCl content on the identification of volatile compounds

2.1.5 解析时间对萃取效果的影响 萃取头上的香气物质在气相色谱仪进样口进行热解析时,一方面解析时间不足则导致解析不彻底,香气物质残留在萃取头上,从而影响下一个样品分析;另一方面固相微萃取的萃取头具有一定的寿命,解析时间较长会缩短其吸附能力[25]。由图5可知,解析时间在2～6 min内,总峰面积和峰个数不断增加,但是当解析时间超过6 min时,峰面积和峰个数都呈现下降趋势。综合考虑,应该选择最适解析时间为6 min。

图5 解析时间对萃取效果的影响Fig.5 Effect of desorption time on the identification of volatile compounds

2.2 正交实验结果与分析

在单因素实验的基础上,对萃取温度、萃取时间、乙醇含量、NaCl添加量四个因素设计如表1所示的4因素3水平正交实验,正交实验结果如表2所示。

表2 正交实验结果分析Table 2 Results and analysis of orthogonal array experiments

由表2可知，首先以总峰面积为评价萃取效果的指标,由极差可知,萃取时间对其萃取效果影响最大,NaCl的添加量次之,随后是乙醇含量,萃取温度对萃取效果影响最小。根据表2中萃取峰面积的数据可知,最佳的萃取条件应为A3B3C2D1,即萃取温度50 ℃,萃取时间50 min,乙醇含量10%,NaCl的添加量1.0 g。其次是以香气物质的个数为评价萃取效果的指标,由极差可知,萃取温度对于萃取效果影响最大,萃取时间次之,随后是乙醇含量,NaCl的添加量对萃取效果影响最小。由表2中萃取峰个数的数据可知,最佳的萃取条件是A3B2C2D1,即萃取温度50 ℃,萃取时间40 min,乙醇含量10%,NaCl的添加量1.0 g。对于不同的评价指标,各个因素的主次顺序也不相同。由于萃取头具有一定的使用寿命,萃取时间较长可能会减少其使用寿命。因此,综合考虑以及参考其它资料最终确定HS-SPME最佳的萃取条件为:萃取温度50 ℃、萃取时间40 min、乙醇含量10%、NaCl的添加量1.0 g,在此条件下所得到的峰个数为81,峰面积为2.01×109。

2.3 红枣白兰地中香气物质的检测

在最佳的HS-SPME条件下对红枣白兰地进行香气物质的测定,其总离子流图如6所示,香气物质分析如表3所示。

表3 红枣白兰地SPME-GC-MS分析结果Table 3 Results for jujube brandy from SPME-GC-MS

续表

图6 红枣白兰地中香气成分物质的总离子流图Fig.6 Total ion chromatogram of aroma compounds in jujube brandy

通过HS-SPME萃取红枣白兰地中的香气成分,共检测到81种物质,其中确定结构的有59种,其中酯类物质34种、醇类物质7种、酸类物质4种、醛类物质6种、其它物质8种。59种香气物质中,通过嗅闻鉴定出的香气物质共有51种,占总香气物质的97.46%。由此可知,红枣白兰地中的香气物质主要为酯类物质共占85.47%,其中主要的香气物质是苯甲酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯,相对含量达到10%以上;其次是辛酸乙酯、己酸乙酯及9-十四碳烯酸乙酯,相对含量都大于5%,所有的酯类物质赋予红枣白兰地更多的水果味。酸类物质共占4.61%,其中月桂酸赋予酒样香味,乙酸、壬酸、癸酸则呈现出一些酸味、脂肪味、难闻的气味。醛类物质共占4.51%,其中苯甲醛的相对含量达到2.64%,它呈现出更多的苦杏仁味,其它醛类物质给予酒样水果、柑橘等香味。醇类物质共占3.67%,其中3-甲基丁醇相对含量最高,能够达到1.55%,它呈现出更多难闻的气味;其它醇类物质含量不高,但给予酒样柠檬、花香、醇香等风味。其它物质共占1.74%,包括一些酮类、烷烃、苯酚等其它物质,它们所赋予酒样的香气较少。

3 结论

利用单因素结合正交实验方法研究了固相微萃取的萃取温度、萃取时间、NaCl添加量、乙醇含量以及解析时间对红枣白兰地中香气成分萃取效果的影响。研究结果表明:当萃取温度50 ℃,萃取时间40 min,乙醇含量10%,NaCl添加量1.0 g,解析时间6 min时,红枣白兰地中的香气成分萃取效果最好。采用顶空固相微萃取对红枣白兰地中的香气成分进行萃取,采用气相色谱质谱联用技术结合计算机检索对其香气成分进行分析,最终确定红枣白兰地中的香气物质共81种,其中鉴定结构的有59种,其中酯类物质34种(85.47%)、醇类物质7种(3.67%)、酸类物质4种(4.61%)、醛类物质6种(4.51%)、其它物质8种(1.74%)。最主要的香气物质是酯类物质,如:月桂酸乙酯(14.23%)、苯甲酸乙酯(14.63%)、癸酸乙酯(12.15%)等,它们构成了枣香和水果香的独特味道。该研究结果对红枣白兰地中的特征风味物质及其开发利用提供了一定的理论依据。

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