SAHA抑制乳腺癌ER受体阳性细胞系MCF-7细胞侵袭的形态学观察

刘春阳，周伟强

（1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2016级，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳医学院基础医学院，辽宁省环境污染与微生态重点实验室）

有研究发现，70%～80%的乳腺癌患者的雌激素受体（estrogen receptor，ER）表达为阳性［1-3］。ER与多种生长因子及激酶相互作用促进肿瘤的增殖与转移，提示在乳腺癌的发生发展过程中，ER对于乳腺癌的进展扮演着重要角色。因此设法通过促进ER的降解而降低其表达水平，抑制肿瘤细胞的增殖，有可能成为乳腺癌耐药患者新的治疗策略［4］。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi）是一类与组蛋白乙酰化酶有拮抗作用的化合物［5］。HDACi通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度，而诱导诸如p53、p21CIP1等抑癌基因的表达水平，最终抑制肿瘤细胞的增殖。作为HDACi的一种，SAHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）对肿瘤细胞迁移、侵袭、转移具有抑制作用，但其作用机制还不是十分的清楚［6-7］。因此本文将SAHA作用于乳腺癌ER受体阳性细胞系MCF-7，通过形态学实验观察SAHA对MCF-7细胞转移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞株MCF-7由本实验室冻存；RPIM-1640培养液、胎牛血清等细胞培养试剂购自美国Thermo公司；SAHA及人重组Leptin蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司；细胞染色液购自美国Cell Biolabs公司；Tanswell小室购自美国Corning公司；其他的化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人乳腺癌MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清，100 U/ml的青霉素，100μg/m l的链霉素的RPIM-1640培养液中，待细胞铺满培养皿70%～80%时用于下面各个实验。

1.2.2 细胞增殖实验 将5×105/ml的MCF-7细胞接种于6孔板的各个孔中。加入无血清培养液培养24 h进行细胞同步化。将10μmol/L SAHA与含10%血清的正常培养液加入细胞中共同培养24 h。另取0.625 nmol/L Leptin作为细胞增殖诱导剂与SAHA共同作用。将各组细胞加入10 μmol/L BrdU孵育60min后，加入包被Fluorescein的抗BrdU抗体（Millipore）室温孵育1 h后，应用Leica DMI6000 B荧光显微镜观察，本实验重复3次。

1.2.3 细胞划痕实验 将3×105/ml的MCF-7细胞接种于24孔板的各孔中。当细胞铺满至90%时，用无菌200μl移液枪头在24孔板各孔中心位置划一条垂直线。PBS洗3次去除划下的细胞后加入无血清RPIM-1640培养基同步化处理24 h。加入10μmol/L SAHA与MCF-7细胞共同孵育0、4、12、24、32、48、72 h后分别取样，加入400 µl细胞染液。待染色15min后应用Leica DMI6000 B显微镜观察，本实验重复3次。

1.2.4 Transwell实验 取RPIM-1640稀释的100 μl Matrigel胶分别加入24孔Transwell各室中，37℃孵育4 h。将6×106/ml的MCF-7细胞培养于60mm培养皿中，待细胞铺满率＞50%时，加入10μmol/L SAHA共同孵育24 h后，以5×105/m l比例悬浮细胞并移入Transwell上室200μl，Transwell下室加入含5μg/ml Fibronectin的600μl细胞培养液，37℃培养24 h。将附有细胞的Transwell膜剪下，Calcein A M染色10 min，应用Leica DMI6000 B显微镜观察，本实验重复3次。

2 结果

2.1 SAHA干扰了MCF-7细胞DNA复制 从图1中可以发现，对照组细胞荧光点散在分布于细胞质中，SAHA处理后的细胞大多呈梭形，变细长，细胞质呈放射状向外突出，并发生胞质外渗现象，荧光点散在分布于细胞内，核周分布较少。而经细胞增殖诱导剂Leptin处理后荧光明显增强，且核周显现大量整合BrdU荧光点的信号。

图1 细胞增殖实验检测SAHA对乳腺癌MCF-7细胞DNA复制能力的影响（Leica DMI6000 B显微镜）

2.2 SAHA显著抑制了乳腺癌MCF-7细胞迁移力 从图2中可以看出，SAHA作用MCF-7细胞4 h时对细胞无明显作用。当作用12 h时可发现划痕边缘细胞开始变少，鲜见向划痕中心游走的细胞。当SAHA作用24 h时，划痕边缘细胞明显减少、脱落，开始向周围散落。当SAHA作用32 h时，细胞形态发生明显变化，细胞呈星状、针形。当SAHA作用48 h后，划痕周围的细胞已大部死亡。而Lepitn处理的MCF-7细胞形态完好，32 h后就大部分填满划痕缺口。

2.3 SAHA抑制了乳腺癌细胞系细胞侵袭力 从图3 Transwell实验结果中可以发现，SAHA处理后的乳腺癌细胞穿透Transwell膜的数量明显少于对照组和Leptin处理组，并且穿过膜的细胞生长状态不好，大多已聚团死亡。而Leptin处理组的细胞穿透Transwell膜的细胞数量明显增多，细胞铺展良好，显示较好的生长状态。

3 讨论

组蛋白是真核生物核染色体的重要组成成分。核心组蛋白可以通过乙酰化和去乙酰化修饰调控DNA的表达，因此组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰是生物体内基因转录调控的关键调控系统。SAHA通过促使染色体的解聚，激活抑癌基因的转录而影响肿瘤细胞的增殖过程［8-10］。

图2 细胞划痕实验检测SAHA对乳腺癌MCF-7细胞游走性的影响（Leica DMI6000 B显微镜，20×）

本实验结果显示SAHA显著限制MCF-7游走性。经10μmol/L SAHA处理MCF-7细胞后划痕边缘细胞明显减少、脱落，细胞形态发生明显变化，细胞呈星状、针形。细胞增殖实验可以看出，SAHA处理后的细胞细胞质呈放射状向外突出，并发生胞质外渗现象，荧光点散在分布于细胞内，核周分布较少。Transwell实验显示，SAHA处理后的细胞穿透Transwell膜的数量明显少于对照组和Leptin处理组，并且穿过膜的细胞生长状态不好，大多已聚团死亡。这些形态学的观察都证实SAHA确实限制了MCF-7细胞的侵袭能力。

本文从形态学角度观察了SAHA对乳腺癌MCF-7细胞侵袭力的影响，具有重要的科学和临床应用价值，但其具体的作用途径有待进一步研究。

参考文献：

［1］王林，曹红，庞雪利，等.瘦素对人乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭的影响及其机制［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（12）：1272-1276.

［2］Mishra DR，Chaudhary S，Krishna BM，et al.Identification of critical elements for regulation of inorganic pyrophosphatase（PPA1） in MCF7 breast cancer cells［J］.PLoS One，2015，10（4）：e0124864.

［3］Lu HG，Zhan W，Yan L，et al.TET1 partially mediates HDAC inhibitor-induced suppression of breast cancer invasion［J］.Mol Med Rep，2014，10（5）：2595-2600.

［4］Robertson FM，Chu K，Boley KM，et al.The class IHDAC inhibitor Romidepsin targets inflammatory breast cancer tumor emboli and synergizes with paclitaxel to inhibitmetastasis［J］.J Exp Ther Oncol，2013，10（3）：219-233.

［5］Müller BM，Jana L，Kasajima A，et al.Differential expression of histone deacetylases HDAC1，2 and 3 in human breast cancer--overexpression of HDAC2 and HDAC3 is associated with clinicopathological indicators of disease progression ［J］.BMC Cancer，2013，13：215.

［6］魏兰，苏敏，黄云秀，等.瘦素通过上调IL-18表达促进人乳腺癌MCF-7细胞迁移及侵袭［J］.肿瘤，2015，35（8）：827-833.

［7］Park SY，Jun JA，Jeong KJ，et al.Histone deacetylases 1，6 and 8 are critical for invasion in breast cancer［J］.Oncol Rep，2011，25（6）：1677-1681.

［8］Robertson FM，Woodward WA，Pickei R，et al.Suberoylanilide hydroxamic acid blocks self-renewal and homotypic aggregation of inflammatory breast cancer spheroids［J］.Cancer， 2010， 116（11 Suppl）：2760-2767.

［9］Noh H， Park J， Shim M， et al.Trichostatin A enhances estrogen receptor-alpha repression in MCF-7 breast cancer cells under hypoxia［J］.Biochem Biophys Res Commun，2016，470（3）：748-752.

［10］Wu S，Luo Z，Yu PJ，et al.Suberoylanilide hydroxamic acid（SAHA） promotes the epithelial mesenchymal transition of triple negative breast cancer cells via HDAC8/FOXA1 signals［J］.Biol Chem，2016，397（1）：75-83.