镧暴露对子代大鼠早期神经行为发育的影响

刘慧颖，李鹏飞，刘艳，奉姝，王家骏，李漫

（沈阳医学院公共卫生学院环境卫生学教研室，辽宁 沈阳 110034）

稀土元素（rare earth elements，REEs）是广泛存在于自然界的一组化学性质相近的镧系元素。我国是稀土资源最多的国家，其储量、产量和出口量均居世界首位。镧是轻稀土元素的代表，常被用作REEs的神经毒性研究［1-2］。已有研究发现神经系统在发育早期对外界有害物质的毒性作用极为敏感［3］，而行为发育指标的测定对于确定环境污染物的神经毒性作用具有重要的实际意义［4］。研究发现镧暴露可导致儿童或实验动物认知能力下降［2，5］。但关于镧暴露对子代大鼠生长发育和神经行为反射影响的研究较少。因此，本研究拟建立生命早期镧暴露的动物模型，就孕鼠镧暴露对子代大鼠生理发育、神经行为反射以及空间记忆能力的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 氯化镧（Lanthanum chloride，LaCl3）分析纯（国药沈阳化学试剂有限公司）。Morris水迷宫（美国Stoelting公司）。

1.2 实验动物 选取40只清洁级Wistar大鼠，其中雄性12只，雌性28只，体重（240±10）g，由中国医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（辽）-2013-0001。实验动物室温度（23±1）℃，相对湿度（50±5）%。动物饲料由沈阳市于洪区前民动物实验饲料厂提供。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及染毒方法 大鼠适应性饲养1周后，将雌性大鼠按体重随机分为4组：对照组和低、中、高剂量染镧组，每组7只，雌∶雄大鼠以1∶1比例同笼，次日阴道分泌物镜检有精子者记为妊娠0 d，将孕鼠单笼饲养，以自由饮水方式进行染镧。对照组饮用蒸馏水，低、中、高剂量染镧组分别饮用含有 0.25%、0.50%、1.00%LaCl3蒸馏水溶液，子代大鼠断乳前通过母乳染毒，断乳后通过自由饮水连续染毒1个月结束。

1.3.2 生理发育指标 （1）体重：在子代大鼠出生后第 7、14、21、28、35、42、49天（postnatal day，PND4，7，14，21，28，35，42，49）上午定时称量并记录体重。（2）张耳：于PND5开始观察子代大鼠张耳，直到双耳廓完全张开并达到完全直立，计算平均张耳时间。（3）开眼：于PND10开始观察子代大鼠开眼，直到覆盖在眼睛上的膜完全消失同时可见裂隙，计算平均开眼时间。（4）门齿萌出：于PND5开始观察子代大鼠出牙，直至有一颗门齿长出牙床，计算平均门齿萌出时间。（5）长毛：于PND5开始观察子代大鼠长毛，直至子代大鼠全身被覆白色绒毛，计算平均长毛时间。

1.3.3 神经行为反射指标 于PND5开始检测并记录达标天龄，直至全部子代大鼠达标。（1）平面翻正反射实验：将子代大鼠仰放于粗糙的木板平面上，松手后其能在3 s内翻正，且四肢同时着地为达标；（2）负趋地性反射实验：在一倾斜25°的底板上将子代大鼠头朝下摆正，1min内子代大鼠调转头位180°为达标；（3）悬崖回避实验：将子代大鼠放在一个20 cm高的台面的边缘，1min内子代大鼠离开边缘返回或转身即为达标。计算各组子代大鼠各项指标达标的平均天数。

1.3.4 空间记忆能力检测 Morris水迷宫实验：取断乳后30 d的子代大鼠进行水迷宫训练。水迷宫为直径150 cm，高60 cm，水深32 cm，水温（22±2）℃，实验室温度保持在24～25℃。加入淀粉使水呈不透明状态。将水池分为4个象限，在第二象限中央放置一个圆柱形平台，平台顶端置于水面下2.0 cm。实验的训练时间为5 d，每天训练4次，子代大鼠随机从4个不同象限入水，记录其从入水至爬上平台的时间，即隐匿平台逃避潜伏期。爬上平台后停留20 s；如子代大鼠在60 s内没有找到平台，则使用木棍引导其至平台并停留20 s，隐匿平台逃避潜伏期计为60 s。1周后，经训练的子代大鼠在相同环境下再次被置于水池中，进行定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验与训练时一样，记录子代大鼠的隐匿平台逃避潜伏期、游泳距离。定位航行实验结束后，间隔10min撤除平台，进行空间探索实验，观察并记录60 s内动物在原平台所在象限穿越目标的次数。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料采用（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析。进一步进行2组间的比较，方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Tamhane's T2 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LaCl3对子代大鼠体重增长的影响 与对照组比较，低剂量染镧组子代大鼠在PND35、PND42、PND49体重显著降低（P＜0.05）；中剂量染镧组子代大鼠在 PND28、PND35、PND42、PND49体重显著低于对照组（P＜0.05），在PND49体重显著低于低剂量染镧组（P＜0.05）；高剂量染镧组子代大鼠在 PND28、PND35、PND42、PND49体重显著 低 于 对 照 组（P＜0.05），在 PND35、PND42、PND49体重显著低于低剂量染镧组（P＜0.05），在PND49体重显著低于中剂量染镧组（P＜0.05），见表1。

2.2 LaCl3对子代大鼠生理发育指标的影响 与对照组比较，染镧组子代大鼠的生理发育指标，包括张耳、开眼、门齿萌出和长毛的时间无明显变化，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 LaCl3对子代大鼠神经行为反射指标的影响 中、高剂量染镧组子代大鼠平面翻正反射的达标时间显著长于对照组（P＜0.05）；高剂量染镧组子代大鼠悬崖回避的达标时间显著长于对照组（P＜0.05）；中剂量染镧组子代大鼠负趋地性反射的达标时间显著长于低剂量染镧组（P＜0.05），高剂量染镧组子代大鼠达标时间显著长于对照组和低剂量染镧组（P＜0.05），见表3。

表1 各组子代大鼠体重增长情况（±s，g）

表1 各组子代大鼠体重增长情况（±s，g）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与低剂量染镧组比较，2）P＜0.05；与中剂量染镧组比较，3）P＜0.05

组别对照组低剂量染镧组中剂量染镧组高剂量染镧组n 8 8 8 8 PND7 17.25±1.04 16.75±1.67 16.63±1.06 16.78±1.34 PND14 25.50±1.60 26.13±1.36 24.63±1.85 24.13±1.89 PND21 37.75±1.67 38.50±2.39 36.00±2.00 35.03±2.20 PND28 61.13±2.48 59.25±2.61 56.38±2.881）57.75±3.911）PND35 95.25±3.92 89.13±4.551）84.25±5.421）79.13±4.291）2）PND42 144.00±7.01 128.63±6.521）117.75±9.431）102.13±10.911）2）PND49 194.13±14.22 169.88±6.881）151.25±8.011）2）136.38±5.501）2）3）

表2 各组子代大鼠生理发育情况（±s，d）

表2 各组子代大鼠生理发育情况（±s，d）

组别对照组低剂量染镧组中剂量染镧组高剂量染镧组n8 8 8 8张耳5.13±0.35 5.00±0.00 5.25±0.46 5.13±0.35开眼13.75±0.46 14.00±0.76 14.25±0.89 14.00±0.76门齿萌出9.63±0.74 10.00±0.93 10.13±0.84 10.03±0.82长毛7.00±0.76 7.38±0.52 7.13±0.64 7.50±0.54

表3 各组子代大鼠神经行为反射指标情况（±s，d）

表3 各组子代大鼠神经行为反射指标情况（±s，d）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与低剂量染镧组比较，2）P＜0.05

组别对照组低剂量染镧组中剂量染镧组高剂量染镧组n8 8 8 8平面翻正反射5.25±0.46 5.50±0.54 6.50±0.761）7.75±1.171）2）悬崖回避5.50±0.76 5.88±0.99 6.13±1.47 6.75±1.491）负趋地性反射6.50±0.93 6.50±0.54 8.00±1.072）8.75±0.891）2）

2.4 LaCl3对子代大鼠空间记忆能力的影响 Morris水迷宫结果显示，在定位航行实验中，各剂量染镧组子代大鼠的逃避潜伏期和游泳距离均长于对照组，中、高剂量染镧组子代大鼠的逃避潜伏期和游泳距离均长于低剂量染镧组，高剂量染镧组子代大鼠的逃避潜伏期和游泳距离均长于中剂量染镧组（P＜0.05）；在空间探索实验中，中、高剂量染镧组子代大鼠穿越平台次数低于对照组，高剂量染镧组子代大鼠穿越平台次数低于低剂量染镧组（P＜0.05），见表4。

表4 各组子代大鼠在Morris水迷宫实验中空间记忆成绩（±s）

表4 各组子代大鼠在Morris水迷宫实验中空间记忆成绩（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与低剂量染镧组比较，2）P＜0.05；与中剂量染镧组比较，3）P＜0.05

组别对照组低剂量染镧组中剂量染镧组高剂量染镧组n 8 8 8 8定位航行实验逃避潜伏期（s）26.92±7.50 33.52±1.051）41.12±6.371）2）48.53±6.461）2）3）游泳距离（m）5.19±1.31 6.37±0.261）7.65±0.821）2）8.29±0.981）2）3）空间探索实验穿过平台的次数3.88±1.25 2.75±1.49 1.63±1.061）0.88±0.841）2）

3 讨论

镧是一种应用广泛的轻稀土元素，在环境介质和食品中含量较高，能够通过血脑屏障进入脑组织并在其中蓄积。流行病学调查发现居住于稀土矿区的少年儿童在智商均数和认知能力等方面均较对照区儿童明显低下［6］。动物实验证实，镧可导致大鼠学习记忆能力下降［7-8］。说明镧具有神经毒性，因此镧暴露的预防及干预的研究越来越受到人们的关注。

研究发现，发育中的中枢神经系统对外源性化学物质的毒性特别敏感。由于神经系统的复杂性，通常采用行为各方面的指标综合评价外源性化学物质的神经行为毒性。综合以往的研究，我们选择了动物早期的生长发育水平、神经行为反射能力和空间记忆能力来探究镧对神经系统的损伤。本研究结果显示，PND28、PND35、PND42、PND49镧暴露组子代大鼠的体重较对照组明显下降，说明镧暴露抑制了子代大鼠体重的增长，这与以往的研究结果［9］相一致。与对照组相比，镧暴露组子代大鼠的张耳、开眼、门齿萌出和长毛指标无明显变化，说明通过胎盘和早期乳汁吸收的镧并不能损害子代大鼠的生理发育能力。通过平面翻正反射实验、悬崖回避实验和负趋地性反射实验可以看出，随着镧暴露剂量的增加，各组子代大鼠达标时间延长，说明镧暴露对神经反射行为能力有一定的影响。同时，也说明神经行为反射指标对于神经系统的早期损害比较敏感。

Morris水迷宫实验是神经行为学中最常用的测试方法之一，常被用来评估啮齿类动物的空间学习记忆能力［10］。Morris水迷宫主要包括定位航行和空间探索实验。定位航行实验主要记录动物寻找隐藏在水面下2 cm平台所需的时间（逃避潜伏期）和游泳距离，逃避潜伏期及游泳距离越长说明动物的记忆力越差。空间探索实验记录的是撤去平台后实验动物穿越原平台的次数，次数越少动物记忆能力越差。有报道显示，大鼠摄取40mg/kg LaCl36个月后，在Morris水迷宫实验中的神经行为表现明显异常［8］。本研究发现，在定位航行实验中，染镧组子代大鼠的逃避潜伏期和游泳距离显著长于对照组。在空间探索实验中，中、高剂量染镧组子代大鼠穿越平台次数显著低于对照组，表明镧暴露可显著损伤子代大鼠的空间记忆能力。

综上所述，本研究发现镧能延缓子代大鼠的体重增长，影响其神经行为反射能力和空间记忆能力，说明镧具有明显的神经毒性。而镧是否对机体的其他系统具有毒性以及其毒性作用机制仍有待于进一步的研究。

参考文献：

［1］Jin C，Gao L，Li Y，et al.Lanthanum damages learning and memory and suppresses astrocyte-neuron lactate shuttle in rat hippocampus［J］.Exp Brain Res，2017，235 （12）：3817-3832.

［2］Liu H， Yang J， Liu Q， et al.Lanthanum chloride impairs spatial memory through ERK/MSK1 signaling pathway of hippocampus in rats［J］.Neurochem Res， 2014， 39 （12）：2479-2491.

［3］张玉媛，王取南，王志刚，等.出生后接触氰戊菊酯对仔鼠神经行为发育及学习记忆的影响［J］.毒理学杂志，2008，22（2）：88-91.

［4］Branchi I，Alleva E， Costa LG.Effects of perinatal exposure to a polybrominated diphenyl ether （PBDE 99） on mouse neurobehavioural development［J］.Neurotoxicology， 2002， 23（3）：375-384.

［5］Zhang L，Yang J，Jin C， et al.The effect of nuclear factor erythroid 2-related factor/antioxidant response element signalling pathway in the lanthanum chloride-induced impairment of learning and memory in rats［J］.J Neurochem，2017，140（3）：463-475.

［6］范广勤，郑辉烈，袁兆康.稀土暴露对儿童智商的影响［J］.环境与健康杂志，2005，22（4）：256-258.

［7］Zheng L，Yang J，Liu Q，et al.Lanthanum chloride impairs spatial learning and memory and downregulates NF-κB signalling pathway in rats［J］.Arch Toxicol，2013， 87 （12）：2105-2117.

［8］Feng L，Xiao H，He X，et al.Long-term effects of lanthanum intake on the neurobehavioral development of the rat［J］.Neurotoxicol Teratol，2006，28（1）：119-124.

［9］杨敬华，刘秋芳，巫生文，等.镧对大鼠海马CA3区cAMP应答元件结合蛋白磷酸化和及刻早期基因表达的影响［J］.卫生研究，2011，40（3）：299-303，311.

［10］Brandeis R，Brandys Y，Yehuda S.Theuse of the Morris Water Maze in the study of memory and learning［J］.Int J Neurosci，1989， 48（1-2）：29-69.

（文敏编辑）