外源ALA对克瑞森无核葡萄叶片光合特性及果实品质的影响

张梦燕，孙军利*，赵宝龙

(1 石河子大学 农学院，新疆石河子 832000；2 特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832000)

随着市场对鲜食葡萄果实品质要求的提高，如何改善果实外观品质和促进果实着色成为广大果树工作者普遍关心的问题。新疆是葡萄种植的优势产区，虽具有丰富的光热资源，但在设施葡萄生产中存在着一些葡萄品种着色困难的问题。克瑞森无核(Crimson Seedless)，别名克伦生无核、淑女红无核，为晚熟无核葡萄品种，属欧亚种。该品种自根苗生长势强，树势旺，易形成花芽，易丰产，但若负载量过大或管理不善易发生着色不良现象。随着人们对食品安全的日益重视，着色剂的使用往往会引起消费者的不安，选择绿色友好型的物质促进果实着色、提高果实品质已经成为当前迫切需要研究的重要生产问题。

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)作为自然界生物体内天然存在的一种生理活性物质，是所有生物体卟啉化合物(叶绿素、光敏色素、维生素B、亚铁血红素等)生物合成的第一个关键前体[1]，调节植物生长发育，被视为一种新的生长调节物质。相关外源试验表明，适宜质量浓度的ALA处理能够显著提高植物叶片光合效率，促进作物生长，增强其抗逆性[2-3]。日光温室番茄叶片通过ALA处理后，番茄植株的叶绿素含量明显提高，且番茄果实产量和品质也有明显的提高和改善[4]。还有研究指出,ALA与葡萄、苹果果皮花青素合成积累密切相关，ALA处理能够诱导花青素合成相关基因的表达，促使花青素含量显著高于对照，果实品质明显提高[5]。随着果实中花青素合成研究迅速发展，人们认识到花青素含量与果实着色有着密切联系，且花青素是使葡萄果实表面呈现出红、紫红到蓝等不同颜色的主要原因[6]。在‘早白花’桃果实着色前利用不同质量浓度ALA溶液涂布果实，结果发现ALA处理不仅促使果皮花色素苷大量积累，还能够使果实提前着色，进而推测ALA参与了果实花色素苷合成的调控，对果皮花色素苷的提早合成具有促进作用[7]。ALA促进果实花青素合成积累已有大量报道，但有关ALA是如何通过色素类物质的调控来影响果实着色效果的研究尚较少。因此， 本试验以日光温室栽培欧亚葡萄品种克瑞森无核为试验材料，研究不同质量浓度ALA处理对葡萄果实着色效果及相关生理指标变化的关系，探讨外源ALA对叶片光合性能的作用效果，为ALA在葡萄生产上推广应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与处理

试验于2017年5月在石河子农业科学研究院葡萄研究所示范基地进行，试材选取基地内的3年生欧亚葡萄品种克瑞森无核。葡萄采用水平连叠式棚架栽培，株行距0.5 m×3.5 m，东西行向，葡萄果实性状表现均匀一致，设施栽培常规管理。于果实膨大期(6月15日)及始熟期(6月25日)选择架势、长势和负载量均相似的葡萄植株，每株随机选取大小一致的果穗及同侧节位中发育良好、无病虫害的结果枝功能叶挂牌做好标记，分别用50、100 和150 mg·L-1的ALA溶液于当日傍晚喷施葡萄标记叶片及果穗，以清水喷施作为对照。从最后一次处理之日后，各处理每隔1周取果穗样1次，直至果实成熟，共取样5次。取样时随机从各处理植株上采摘3穗带标签果穗，作为3次重复。样品采集后，从各处理果穗上随机选取10粒长势一致的果实，剥取果皮立即放入液氮中，于-80超低温冰箱中贮存，用于花青素含量的测定；剩余各处理果穗带回实验室，用于测定葡萄果实的各项生理指标。

1.2 测定指标及方法

1.2.1叶片光合生理指标叶片光合参数分别于葡萄果实始熟期(花后45 d大部分果实褪绿，进入转色，6月25日)和果实成熟期(大部分果粒变软，果皮呈色鲜艳均匀，7月30日)进行测定，各处理选择做好标记的植株叶片，在两个时期分别选择一晴天，于10:00～18:00每隔2 h测定1次，每次每株测定3片叶，重复3次。测定采用开放式气体交换Li-6400便携式光合作用测定系统，测定指标包括各处理葡萄叶片胞间CO2浓度(Ci，μmol·mol-1)、气孔导度(Gs，mmol·m-2·s-1)、蒸腾速率(Tr，mmol·m-2·s-1)、净光合速率(Pn，μmol·m-2·s-1)。

1.2.2果实品质及色泽指标果实色泽指标采用NC-9801 手持色差计测定。在果实成熟期各处理果穗中随机选取15粒长势均匀一致的果实，测定每个果实赤道部位的色泽指标。包括果面色泽明亮度(L*)、颜色组分(a*、b*)，同时得到色泽饱和度(C*)、色度角(h°)，最终通过L*、C*、h°计算葡萄果实着色指数CIRG，重复3次。其中，C*值越大表示果面色泽越鲜艳，着色效果越好；而葡萄果实颜色指数CIRG的大小表示果实的外观色泽，即CIRG < 2表现为黄绿色，2 < CIRG < 4 表现为粉红色，4 < CIRG < 5 表现为红色，5 < CIRG < 6 表现为深红色，CIRG> 6 表现为蓝黑色[8]。

1.2.3果实品质果实可溶性糖含量测定釆用蒽酮比色法[9]，可滴定酸含量的测定采用NaOH滴定法[10]。

果皮花青素含量的测定参照王慧聪[11]的方法并加以改进。各处理分别称取液氮速冻的葡萄果皮1 g剪碎混匀加入10 mL 1%盐酸-甲醇溶液，32 ℃恒温箱中提取4 h以上，过滤，滤液为花青素提取液。用紫外分光光度计分别在553 nm和600 nm处测定提取液的吸光值D553和D600，花青苷含量=D553-D600。差值每增加0.01定义为一个单位(U)的花青苷含量，重复3次，取平均值。

果皮叶绿素与类胡萝卜素含量的测定参照李伟[12]王枝翠[13]的方法并加以修改。各处理分别称取新鲜葡萄果皮 0.2 g剪碎混匀加入10 mL丙酮乙醇混合提取液，在黑暗条件下浸提24 h，待果皮变白，取滤液分别用紫外分光光度计测定在663 nm、645 nm、440 nm 波长处的吸光度值，重复3次。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2007软件进行数据分析，用SPSS 19.0软件进行方差分析，利用Origin 9软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度ALA处理对葡萄叶片光合指标日变化特性的影响

2.1.1气孔导度植物吸收水分和二氧化碳的主要通道为气孔，植物叶片气孔导度(Gs)的大小将直接影响植物的光合效应。图1显示，各外源ALA处理和对照葡萄叶片Gs在始熟期和成熟期表现相同的升高-降低-再升高-再降低双峰日变化曲线。其中，它们的Gs均在12:00和16:00分别达到最高峰和次高峰，于14:00表现为最低值；整个葡萄叶片Gs在两时期日变化过程中，3种浓度ALA处理均较相应对照有不同程度的增加，并以100 mg·L-1的ALA处理表现最好，其Gs在着色期12:00和16:00相比对照分别显著高出16.8%和15.4%，成熟期分别较对照显著高出19.1% 和20.9%(P<0.05)；同时，生育期间比较发现，各处理和对照叶片Gs均表现为始熟期明显大于成熟期。

2.1.2胞间二氧化碳浓度各质量浓度ALA处理葡萄叶片胞间CO2浓度(Ci)在始熟期和成熟期的日变化趋势与其Gs变化规律相似，均呈双峰曲线(图2)。其中，ALA处理后两时期葡萄叶片Ci均高于相应对照，同样以100 mg/L的ALA处理效果最显著，50 和150 mg/L ALA处理效果虽高于对照，但其响应趋势不稳定，可能与处理浓度作用时间不同有关。各ALA处理和对照葡萄叶片Ci均在12:00达到最高，此时50 、100和150 mg·L-1ALA处理叶片Ci在始熟期分别比对照增加了6.3%、11.4%和6.5%，在成熟期分别较对照高出3.5%、14.9%和12.7%；两时期各处理叶片Ci均在14:00最低，这是由于中午光强和气温都较高，促使叶片温度升高，加速水分蒸腾，导致叶片水势下降，气孔关闭，叶片吸收CO2量因此减少。另外，各ALA处理和对照叶片的Ci大小均表现为始熟期大于成熟期。

图1 ALA处理下葡萄始熟期(A)和成熟期(B)叶片气孔导度(Gs)的变化Fig.1 The leaf stomatal conductance(Gs)of Crimson Seedless grape at veraison (A) and maturity (B) stages with ALA treatment

2.1.3蒸腾速率图3显示，无论在始熟期还是成熟期，各质量浓度ALA处理和对照葡萄叶片的蒸腾速率(Tr)日变化均呈双峰曲线，且始熟期各处理和对照的Tr均高于成熟期；相对于Gs和Ci，叶片Tr整体日变化幅度较小。其中，各处理和对照的Tr均随光强增大和叶片蒸腾作用加强于12:00达到最高值，后又因中午叶片光合“午休”现象导致叶片气孔关闭，Tr又于14:00达到最低值；100 mg·L-1ALA处理葡萄叶片的Tr在始熟期和成熟期都显著高于同期对照，50 和150 mg·L-1ALA处理仅在浓度作用响应较大时期显著高于对照。各处理葡萄叶片Tr变化在始熟期以12:00最为明显，而在成熟期以16:00最为明显，此时50、100和150 mg·L-1ALA处理的Tr在始熟期分别比同期对照增加了11.5%、38%和25%，在成熟期较同期对照分别增加了12%、16.4%和7.4%，且差异显著(P<0.05)。

2.1.4净光合速率图4显示，各梯度浓度ALA处理和对照的葡萄叶片净光合速率(Pn)在始熟期和成熟期日变化也均呈双峰曲线，并表现为始熟期明显高于成熟期，且都出现明显的光合“午休”现象。其中，随着光照强度的变化，两时期各浓度ALA处理和对照葡萄叶片Pn均分别在12:00和16:00达到最高峰和次高峰，均在14:00出现低谷，在18:00降到最低值；在始熟期和成熟期葡萄叶片Pn日变化过程中，100 mg·L-1ALA处理的叶片Pn始终高于其他处理和对照，并且在各个测定时刻与对照差异都达显著水平(P<0.05)，而50和150 mg·L-1的ALA处理与同期对照差异不显著或仅在个别浓度时才显著高于对照。以上结果说明，适宜浓度外源ALA处理能够显著提高葡萄叶片Pn，但并不改变其日变化总体趋势。

图2 ALA处理下葡萄始熟期(A)和成熟期(B)叶片胞间CO2浓度(Ci)的变化Fig.2 The leaf intercellular CO2 conductance(Ci)of Crimson Seedless grape at veraison (A) and maturity (B) stages with ALA treatment

图3 ALA处理下葡萄始熟期(A)和成熟期(B)叶片蒸腾速率(Tr)的变化Fig.3 The leaf transpiration rate(Tr)of Crimson Seedless grape at veraison (A) and maturity (B) stages with ALA treatment

图4 ALA处理下葡萄始熟期(A)和成熟期(B)叶片净光合速率的变化Fig.4 The leaf net photosynthetic rate of Crimson Seedless at veraison (A) and maturity (B) stages with ALA treatment

2.2 不同质量浓度ALA处理对葡萄成熟期果实色泽参数的影响

由图5可看出，各质量浓度ALA处理葡萄成熟期果实颜色指数(CIRG)均显著高于对照，50、100和150 mg·L-1ALA处理的CiRG值增幅分别达7.3%、25.5%和16.3%；而果面色泽明亮度(L*)、颜色组分(a*、b*)、色泽饱和度(C*)和色度角(h°)比对照均降低，并以h°值表现最为显著，50、100和150 mg·L-1ALA处理的h°值较对照分别降低4.9%、31.3%和13.0%。其中，100 mg/L ALA处理各个果实色泽参数与对照差异均达显著水平(P<0.05)，150 mg/L ALA处理除a*外也均与对照差异显著，而50 mg·L-1ALA处理的果实仅h°和CiRG值与对照有显著差异。因此，外源ALA处理，尤其是100和150 mg·L-1处理，虽然使得成熟期葡萄果面色泽明亮度变暗，但能够显著促进果实着色，有效改善果实外观色泽。

2.3 不同质量浓度ALA处理对葡萄果实品质的影响

2.3.1可溶性糖和可滴定酸含量在外源ALA处理后25 d内，从葡萄果实始熟期到果实成熟过程中，各ALA处理和对照葡萄果实中可溶性糖含量总体呈线性增长趋势(图6，A)。其中，从处理后到10 d左右，果实可溶性糖含量增长缓慢，且各ALA处理与对照间无显著差异；在处理后10～25 d，果实可溶性糖含量呈较快增加趋势，各处理显著高于对照(P<0.05)，并在处理后25 d效果最为明显，50、100和150 mg·L-1处理较对照分别显著提高了19.8%、31.1%和17.1%。可见，ALA处理能够不同程度提高葡萄果实可溶性糖含量，这种促进效应在处理后15 d开始显现，并保持较高的增长趋势，且以100 mg·L-1ALA处理效果最好。

图5 ALA处理下成熟期葡萄果实色泽参数的变化Fig.5 The ripening grape fruit color parameters of Crimson Seedless grape at maturity stage with ALA treatment

同时，葡萄果实可滴定酸含量在ALA处理后25 d内整体表现出下降趋势，并以对照果实含量水平最高、下降幅度最大(图6，B)。其中，在葡萄果实成熟过程中，ALA处理果实可滴定酸含量始终显著低于对照，从处理后5 d开始便显现效应，且此时50、100和150 mg·L-1ALA处理与对照相差幅度最大，较对照分别降低了51.2%、58.2%和51.8%；伴随果实的成熟，各处理果实可滴定酸含量均持续下降，但100 mg·L-1ALA处理相比50和150 mg·L-1ALA处理效果更稳定，且含量水平最低、处理效果最显著(P<0.05)。

2.3.2果皮花青素、叶绿素和类胡萝卜素含量在ALA处理后25 d内，各处理和对照葡萄果皮花青素、叶绿素和类胡萝卜素含量总体表现出相似的变化趋势，即果皮花青素含量逐渐升高，而叶绿素和类胡萝卜素含量逐渐降低；期间，各果皮色素含量始终以100 mg·L-1ALA处理最高，并明显高于同期对照和其余处理(图7)。其中，伴随着果实发育，各ALA处理葡萄果皮中花青素含量较相应对照都有不同程度的增加，且100 mg·L-1ALA处理效果最显著(P<0.05)；100 mg·L-1ALA处理果皮花青素含量在处理后10d迅速增加，较对照提高了55.1%，至处理后25 d虽呈缓慢增长趋势，但相比对照仍表现出较高的促进效应(图7，A)。同时，随着葡萄果实的着色和成熟，各浓度ALA处理能够有效促进各时期果皮叶绿素含量的积累；在处理后5～10 d，葡萄果实正处于着色阶段，各处理缓解了着色期花青素大量积累对叶绿素合成的屏蔽效应，减小了叶绿素在成熟过程中的降解速率；该促进效果在处理后10 d最为显著，此时50、100和150 mg·L-1处理叶绿素含量分别较对照提高了44.5%、55.7%和41.5%，并以100 mg·L-1ALA处理效果稳定且最为显著(图7，B)。另外，伴随葡萄果实成熟，各ALA处理果皮类胡萝卜素含量均比对照有不同程度的增加，但50和150 mg·L-1处理与对照总体差异不显著，而100 mg/L ALA处理较对照显著提高(P<0.05)；在100 mg·L-1处理后5～15 d开始显现效应且最为明显，处理5、10、15 d时分别相比对照增加54.8%、42.5%和31.2%；随着果实逐渐成熟，各处理和对照果皮类胡萝卜素的降解基本趋于平缓，且其间差异性越来越小。

图6 ALA处理下葡萄果实可溶性糖、可滴定酸含量的变化Fig.6 The soluble sugar and titratable aCid content in Crimson Seedless grape fruit with ALA treatment

图7 ALA处理下葡萄果皮花青素、叶绿素和类胡萝卜素含量的变化Fig.7 The anthocyanin， chlorophyll and carotenoid contents in Crimson Seedless grape fruit with ALA treatment

3 讨 论

目前，有关ALA处理对植物叶片光合效应影响的研究已有大量报道。相关外源试验表明，ALA 可以促进小白菜[14]、萝卜[15]、番茄[16]、黄瓜[17]和西瓜[18]等作物叶片光合作用，增强植物的抗逆性。研究普遍认为，ALA是血红素合成的关键前体物质，而血红素作为呼吸酶的一个非蛋白性辅基，其处理诱导血红素合成，进而促进植物的光合反应[19-20]。从本研究结果来看，ALA处理明显提高了葡萄叶片胞间CO2浓度、气孔导度、蒸腾速率和净光合速率，但这种促进效应并不随ALA浓度的增加而增强，只表现出一种类似于植物激素作用的浓度效应，因此，认为ALA是作为一种生长调节物质调节植物生长以及参与植物光合色素的合成。这与在兔眼蓝莓和苹果上观察到的效果相似。花后喷施300 mg·L-1ALA ，兔眼蓝莓叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率和叶绿素含量较对照都有显著的提升[21]。生长季节喷施0.05～5 mg·L-1ALA ，苹果叶片叶绿素含量、净光合速率和瞬时羧化率也都有不同程度的提高[22]，且这种处理促进效应是长期的。本试验测定的是处理后近1个月的效应，再次证明,ALA对植物叶片光合效率的促进效应是持久的，且与浓度大小无直接关系。

色泽是葡萄浆果品质的重要指标之一，其形成是各种色素综合作用的结果。对葡萄而言，花青苷的种类含量、分布状态对果实着色和品质起决定性的作用，花青苷分子由糖和花色素组成，糖不仅是花青苷合成的关键前体物质，更多是通过信号机制作为信号物质促进花青苷的合成。在葡萄果实盛花期后喷施ALA可显著提高成熟期果实中可溶性糖含量，降低可滴定酸含量，且花青素含量与糖含量呈明显正相关，并以100 mg·L-1ALA处理效应最明显[23]。本研究结果进一步表明，ALA处理后25 d内，克瑞森无核葡萄果实可溶性糖、花青素含量持续增加，叶绿素和类胡萝卜素含量明显高于对照，同时果实着色指数(CIRG)显著提高，可滴定酸含量明显下降。汪良驹等[24]早在苹果上的应用表明，300 mg·L-1ALA处理可明显促进果实着色，改善果实外观品质。不同的是本实验最为明显的浓度为100 mg·L-1，这可能与处理时间、浓度作用时间和物种自身代谢的差异有关。由此看出，一定质量浓度ALA处理对果实糖酸含量的调控能够有效促进花青素的积累。

花青素的表达常常受到果皮中叶绿素和类胡萝卜素含量的干扰。叶绿素迅速降解的时间与花青苷大量合成的时间大致吻合，且在果实发育过程中，叶绿素含量与花青素含量的变化呈极显著负相关[25]。本研究结果与之相似，在果实成熟过程中，葡萄果皮花青素不断积累，同时果皮叶绿素和类胡萝卜素含量持续下降，经ALA处理后的果皮花青素、叶绿素和类胡萝卜素含量都明显高于对照；与前人结果不同的是，本研究发现，ALA处理后5～15 d是果皮花青素迅速积累期，而此时经ALA处理的葡萄果皮叶绿素含量较对照降解速率明显变缓，由此可知，外源ALA在能够有效促进花青素积累的同时，还可以缓解叶绿素迅速降解对花青素合成的屏蔽作用。

综上所述，在果实膨大期和始熟期对葡萄果实和叶片喷施适宜浓度ALA能够显著提高克瑞森无核葡萄果皮叶绿素和类胡萝卜素含量，增强叶片光合效能，有效促进果皮花青素积累，进而使果实着色指数(CIRG)显著增加，果实外观品质得到改善。ALA处理后果实可溶性糖含量明显增加，可滴定酸含量下降，使葡萄果实鲜食风味提高。喷施不同质量浓度ALA对克瑞森无核葡萄果实成熟过程中品质、着色效果和光合性能都有不同程度的提升，并以100 mg·L-1ALA处理总体效果表现最好，各浓度效应之间无规律变化，这可能与不同浓度发生作用效应时间的不同有关。目前，ALA作为天然无毒的调节剂在果树和蔬菜上已有广泛应用，本实验结果将为ALA促进葡萄果实着色及光合性能提供理论依据，同时喷施ALA可以作为葡萄实际生产中改善果实品质的有效技术措施。

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