牡丹PsAGL6基因克隆与表达分析

唐文龙，赵鹏飞，李永华，贺 丹，逯久幸

(河南农业大学 林学院, 郑州 450002)

高等植物的花由外至内依次由花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊组成[1]，不同花器官由不同类型基因所操控。在拟南芥中，控制植物花器官功能基因可被分为A、B、C等3类，称为“ABC”模型[2]。随着D类与E类功能基因先后发现[3]，以及四分体模型假说[4]与同源异形盒理论提出，“ABC”模型已被丰富为“ABCDE”模型。在“ABCDE”等5类功能基因中，E类基因所编码的同源蛋白可作为分子桥梁，与其他类型转录因子形成蛋白复合物，并结合在相邻两段特定DNA区域即CArG盒从而调控下游靶基因表达，调控花器官形成[5]。

目前E类功能基因均来自于MADS_box基因家族中AGL6-like、SEP-like以及AP1/SQUA/FUL-like 3个亚家族。与其他2个E类基因不同，AGL6在被子植物与裸子植物中同时存在[6]。近年来已经从买麻藤[7]、珊状臂形草[8]、水稻[9]多种植物中克隆得到AGL6-like基因。买麻藤AGL6同源基因GGM9与GGM11同时在雄性以及雌性生殖器官中表达，但并未在叶片中表达[7]；珊状臂形草BbrizAGL6基因同样在生殖器官中表达[8]；水稻OsMADS6在分生组织及部分花器官中表达，并与其他花发育同源基因互作调控花器官分化及分生组织形成[9]。AGL6基因在植物花发育中发挥重要作用，但功能机制仍需深入研究。

牡丹为芍药科芍药属牡丹组重要的园林观赏植物。牡丹属于多年生木本植物，实生苗成花期较长，花期较短且胚珠败育率高等严重影响牡丹育种与生产工作。因此研究牡丹花发育相关基因，对深入了解牡丹花发育机制具有重要帮助。目前已经从牡丹中先后克隆了AP1、AP2、SEPALATA、SOC1和FUL等花发育相关基因，并对其功能进行了分析[10]，但有关牡丹AGL6同源基因的研究还未见报道。本研究以牡丹品种‘洛阳红’为材料，结合转录组分析，利用RT-PCR方法克隆AGL6基因cDNA序列；并结合qRT-PCR技术对牡丹各器官及不同花型牡丹品种的花瓣中AGL6基因表达模式进行分析，为深入研究AGL6同源基因在牡丹花器官形成中的功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为10年生牡丹‘洛阳红’植株，种植于河南农业大学实验园区。2016年4月采集盛花期牡丹花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊用于花器官组织特异性分析。同期于郑州西流湖公园采集不同花型的牡丹品种‘白雪塔’(皇冠型)、 ‘王红’(绣球型)、 ‘大金粉’(荷花型)与‘紫金盘’(蔷薇型)花瓣， 并于当年6月初采集‘洛阳红’根、茎、叶、果。所有样品采集后用锡纸包裹，自封袋分装并编号，迅速置于液氮中速冻，再放入-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.2 RNA提取与AGL6基因克隆

用改良CTAB法提取牡丹‘洛阳红’花瓣中总RNA。反转录采用PrimescriptTMⅡ 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa,大连)反转录试剂盒，依照说明书操作。通过对牡丹转录组数据库的检索，获得AGL6同源序列。利用Primer 5.0设计引物，PCR扩增获得AGL6基因序列(表1)。DNA聚合酶采用TaKaRa ExTaq(TaKaRa， 大连)。PCR扩增反应体系如下：稀释后cDNA 2 μL，DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL，10 xTaq缓冲液5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 36.6 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸7 min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根， 北京)纯化，纯化产物连接到pMD-18T载体(天根， 北京)将重组质粒转化到大肠杆菌Top10感受态细胞(天根，北京)，涂于含有AMP+LB固体培养基中，筛选阳性克隆送至公司测序(上海英潍捷基)。

1.3 序列分析

利用DNAMEN5.0软件翻译PsAGL6开放阅读框获得氨基酸序列。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行蛋白保守结构域预测。通过在线工具ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)对该蛋白基本理化性质进行分析； SOMPA(http://expasy.cn/tools)在线工具用来分析该蛋白二级结构；结合Smart-BLAST在线(http://smart.emblheidelberg.de)搜索与PsAGL6相似度较高其他蛋白序列信息。结合ClustalX 2.0软件进行多序列比对，通过MEGA 5.0软件采用Neighbor-joining计算方法构建同源进化树，设置Bootstrap参数为1 000。

1.4 qRT-PCR分析

根据测序获得的PsAGL6基因序列通过primer3软件设计特异性引物(表1)，以Ubiquitin为内参基因进行qRT-PCR反应。反应在Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR System进行，总反应体系为20 μL。反应程序如下：预变性95 ℃ 30 s；预变性95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；60 ℃后延伸30 s。每个样品重复3次，反应结束通过2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。并使用SPSS软件t检验对结果进行差异显著性分析。

表1 引物序列

2 结果与分析

2.1 牡丹PsAGL6 cDNA全长克隆与序列分析

通过检索牡丹转录组数据库，获得牡丹AGL6同源基因序列。以牡丹‘洛阳红’盛花期花瓣cDNA为模版，经PCR扩增并测序得到一个732 bp含有完整开放阅读框的CDS序列(图1)，编码244个氨基酸(图2)。结合Smart-Blast蛋白序列分析，该基因具有完整MADS-box结构域及K box结构域，确定该序列为MADS-box基因家族基因。该基因序列与可可(Theobromacacao)AGL6氨基酸序列，陆地棉(Gossypiumhirsutum)AGL6氨基酸序列具有较高相似度，应属于牡丹中AGL6同源基因，命名为PsAGL6，GeneBank登录号为MF563611。

2.2 PsAGL6基因同源性与系统进化分析

将PsAGL6基因提交至在线Blast中，选择11个一致性较高氨基酸序列，并结合Clustal2.0软件对12条氨基酸序列进行多重序列比对分析(图3)，PsAGL6与葡萄(Vitisvinifera)、可可(Theobromacacao)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)等氨基酸序列一致性较高，分别为79%、75%和74%。结构域分析显示PsAGL6基因包含有MADS MEF Domain、K-box Domain以及典型AGL6 Motif Ⅰ 与AGL6 Motif Ⅱ，从而进一步确定该序列为AGL6同源基因。前人研究显示，MADS-box蛋白中高度保守MADS domain可通过特异识别并结合于转录因子靶基因中特异DNA序列(即CArG盒)，调控基因的时空表达[11]。相对保守K-box Domain主要功能为调控蛋白间互作。而高度不保守C末端中存在特异保守基序。这些基序功能可能与蛋白复合物形成及转录活性有关[12]。PsAGL6蛋白具有AGL6 Motif Ⅰ和Ⅱ保守基序，该基序功能可能也与此类似。

为验证PsAGL6基因亲缘关系，从NCBI数据库筛选到10个物种11个氨基酸序列，与牡丹PsAGL6蛋白序列一同提交至MEGA5.0软件，利用Neighbor-joining 方法构建系统进化树(图4)，牡丹PsAGL6与野茶树CsMADS聚类为一支，序列相似度86%，说明牡丹与野茶树亲缘关系最为接近。

2.3 PsAGL6理化性质和蛋白结构分析

对PsAGL6基因进行理化性质预测分析，该蛋白总分子量为28.3 kD，等电点8.75，偏碱性，平均疏水系数为-0.779，定性为亲水性蛋白。蛋白不稳定指数46.57，推测为不稳定蛋白。结合在线SOPMA程序对蛋白二级结构分析，该蛋白由α螺旋、β转角、无规则卷曲以及扩展链结构构成(图5)。其中4种结构占百分比依次为α螺旋(54.51%)>无规则卷曲(22.54%)>扩展链结构(15.57%)>β转角(7.38%)。α螺旋在该蛋白结构域中承担重要作用，主要位于MADS-box蛋白结构域K-box domain，少部分位于MADS domain(图3和图5)。有研究证实MADS-box蛋白结构域K-domain由3个连续两性α螺旋所构成(即K1、K2和K3)。该结构域中K1与K2参与蛋白二聚体互作，K3涉及高阶复合物形成。而MADS domain中α螺旋与该结构域中的部分蛋白一同结合于CArG盒，调控靶基因表达[11]。

1. DL1000; 2. PsAGL6扩增产物图1 牡丹PsAGL6基因PCR扩增产物1.DL1000; 2. PCR products of PsAGL6 geneFig.1 PCR products of PsAGL6 gene in Paeonia suffruticosa ‘Luoyanghong’

图2 PsAGL6基因ORF序列及推导的氨基酸序列Fig.2 The ORF sequence and deduced amino acid sequence of PsAGL6

TcAGL6. 可可(EOX96140.1); VvMADS3.葡萄(NP_001268111.1); GhAGL6. 陆地棉(NP_001314584.1); HuAGL6.哥伦比亚锦葵(XP_021280322.1); JcAGL6. 麻疯树(XP_012083518.1); CsMADS. 野茶树(AMQ10447.1)图3 PsAGL6基因编码氨基酸与相近AGL6组蛋白比较TcAGL6. Theobroma cacao (EOX96140.1); VvMADS3. Vitis vinifera (NP_001268111.1); GhAGL6. Gossypium hirsutum (NP_001314584.1); HuAGL6. Herrania umbratica (XP_021280322.1); JcAGL6. Jatropha curcas (XP_012083518.1); CsMADS.Camellia sinensis (AMQ10447.1)Fig.3 Comparisons of PsAGL6 amino acid and AGL6 group proteins

2.4 PsAGL6在不同组织和不同花型中的表达分析

对牡丹‘洛阳红’根、茎、叶、果实和种子5个器官和花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊4个花器官进行了组织特异性分析。结果(图6，A)显示，PsAGL6在所有组织中均有表达，但是表达量存在显著差异(P<0.05)。在根、茎和叶中表达量相比果实、种子和花器官中的表达量较低，尤其在叶子中，PsAGL6的表达量达到最低，几乎为0。这表明PsAGL6基因主要与植物的生殖器官发育相关。在4个花器官中，PsAGL6在萼片、花瓣和雌蕊显著表达，相对表达量分别为13.4、9.0和5.0 。

TcAGL6.可可(EOX96140.1)；HuAGL6.哥伦比亚锦葵(XP_021280322.1)； GhAGL6. 陆地棉(NP_001314584.1)； HcMADS. 大麻槿(ADZ98838.1)；GhAGL6-2. 陆地棉(NP_001314565.1)； PpMADS.梨(BAK18784.2)；MdAGL6.苹果(NP_001280892.1)；JcAGL6.麻疯树(XP_012083518.1)； MeMADS6.木薯(XP_021613881.1)；VvMADS3.葡萄(NP_001268111.1);CsMADS.野茶树(AMQ10447.1)图4 PsAGL6及其他物种AGL6氨基酸序列的同源进化分析TcAGL6. Theobroma cacao(EOX96140.1)；HuAGL6. Herrania umbratica(XP_021280322.1)；GhAGL6. Gossypium hirsutum(NP_001314584.1)；HcMADS. Hibiscus cannabinus(ADZ98838.1)；GhAGL6-2. Gossypium hirsutum(NP_001314565.1)； PpMADS. Pyrus pyrifolia var. Culta(BAK18784.2)；MdAGL6. Malus domestica(NP_001280892.1)； JcAGL6. Jatropha curcas(XP_012083518.1)；MeMADS6. Manihot esculenta(XP_021613881.1)；VvMADS3. Vitis vinifera(NP_001268111.1)；CsMADS. Camellia sinensis(AMQ10447.1)Fig.4 Phylogenetic tree of the amino acid sequences of PsAGL6 and other plants

图5 PsAGL6蛋白二级结构预测Fig.5 The structure prediction of PsAGL6 protein

A. S1～S8分别为‘洛阳红’果、叶、茎、根、萼片、 花瓣、雄蕊与雌蕊; B. P1～P4 分别为大金粉、白雪塔、王红、紫金盘; 不同小写字母表示差异显著P<0.05图6 牡丹PsAGL6基因在不同组织(A)和不同花型花瓣(B)中的表达量A. S1-S8. Fruit, leaf, stem, root, sepal, petal, stamen and carpel, respectively; B. P1-P4. The flower type of Lotus, Crown, Hydrangea and Rose; Different letters mean significant difference at 0.05 levelFig.6 Relative expression level of peony tree PsAGL6 gene in various tissues (A) and different double petals (B)

前人研究显示AGL6基因参与花瓣变异，过量表达AGL6基因的植株花瓣数量增多[13-14]，为探究PsAGL6在牡丹中是否也与花瓣数量变化相关。本研究根据花瓣数量的不同选择了荷花型品种‘大金粉’、蔷薇型品种‘紫金盘’、皇冠型品种‘白雪塔’和绣球型品种‘王红’。结果(图6，B)显示，与‘大金粉’、‘王红’和‘白雪塔’相比，PsAGL6基因在蔷薇型品种‘紫金盘’中的相对表达量最高(16.2)，与其他品种差异达到极显著水平。而在荷花型品种‘大金粉’、皇冠型品种‘白雪塔’和绣球型品种‘王红’中，PsAGL6的相对表达量差异不显著。

3 讨 论

AGL6基因是MADS-box基因家族重要成员，隶属于该家族的AGL6亚家族，AGL6亚家族与SEP亚家族互为姊妹关系，共同归类为“E”类功能基因。水稻等多种高等植物中证明AGL6具备与“E”类功能基因相近的调控方式，与花器官形成、种子与胚珠发育、生殖器官及配子体发育等作用相关[15]。本研究以牡丹“洛阳红”为材料，从牡丹花瓣中克隆AGL6-like基因，从序列一致性比对及系统进化分析来看，PsAGL6氨基酸序列分别与葡萄VvAGL6以及野茶树CsMADS亲缘关系接近。保守结构域分析发现，该基因包含有完整的MADS-MEF2、K-box、典型AGL6 Motif Ⅰ与AGL6 Motif Ⅱ，属于MADS-box家族中AGL6同源基因。说明本研究克隆得到的PsAGL6基因应该是牡丹中AGL6基因，所以可能在牡丹中行使相似的功能。

AGL6基因在组织中的表达因物种不同存在很大差异。玉米中AGL6同源基因ZAG3仅在花分生组织中表达，而外稃与雄蕊中不表达[16]。番茄AGL6同源基因SlAGL6在花萼与花瓣中表达，在其他花组织中表达较少。与正常植株相比，沉默AGL6基因的番茄突变体表现出萼片融合，且花瓣呈绿色表型特征，推测可能由于AGL6基因沉默影响到了A类与B类花发育基因表达，进而造成萼片和花瓣的变异[14]。在兰花中，文心兰OMADS6在花萼、花瓣、唇瓣、雌蕊中均有表达，但雄蕊中并无表达，这个结果与我们不同组织特异分析得到的结果一致。在春兰的研究中，AGL6正常瓣与突变碟形瓣中表达量呈现显著差异，推测AGL6基因可能涉及到瓣形变异[13]。本研究中，PsAGL6在根、茎和叶中表达量相比果实、种子和花器官中的较低。这表明PsAGL6基因主要与植物的生殖器官发育相关。在4个花器官中，PsAGL6在萼片、花瓣和雌蕊显著表达。这说明PsAGL6可能主要参与牡丹萼片、花瓣和雌蕊的发育，与雄蕊的发育关联较小。

PsAGL6基因在蔷薇型品种‘紫金盘’中的相对表达量最高(16.2)，与其他品种差异达到极显著水平。而在荷花型品种‘大金粉’、皇冠型品种‘白雪塔’和绣球型品种‘王红’中，PsAGL6的相对表达量差异不显著。PsAGL6基因在花瓣数量较多的蔷薇型品种中超表达，部分地说明PsAGL6基因可能与牡丹花瓣数量增多的变化相关。然而，花瓣数量的增加是个极其复杂的调控过程，有可能是多个基因共同控制的复杂机制，是否存在其他基因的掣肘导致在花瓣数量同样较多的皇冠型品种和绣球型品种的低表达，需要进一步的研究。后期研究应结合花发育相关的其他基因，如SEP等，分析是否存在多个基因共同调控牡丹花器官的发育过程，通过明确基因之间的联系才能更深入揭示AGL6基因在植物花器官分化、形成和发育中的作用机制。

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