巴戟天对卵巢切除大鼠OPG、RANKL蛋白表达的影响*

★ 郑德开 阮诗钒 叶春华 陈琳 陈睿 林海鸣

(福建中医药大学 福州 350122)

骨质疏松(Osteoporosis，OP)是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病，常见于老年人，特别是绝经后的女性，极大威胁和影响着人们的生命健康和生活质量。然而，因其调节机制以及病因病理的复杂性，目前仍无有效的药物将其彻底治愈。随着OPG-RANK-RANKL轴的发现，骨质疏松症的研究取得了突破性的进展[1]，并已经成为药物设计的新靶点。而巴戟天作为我国四大南药之一,具有补肾阳、强筋骨的作用，是治疗骨质疏松症的常用药物[2]，而其作用机制却仍未被阐明。本实验基于OPG-RANK-RANKL轴，通过观察巴戟天对骨质疏松模型大鼠血清E2、OPG和RANKL的影响，探讨巴戟天防治骨质疏松的可能机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 3月龄雌性SD大鼠30只，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号:SCXK(沪)2012-0002，合格证编号：2015000517533。在福建中医药大学动物实验中心鼠类实验室饲养，医学实验动物环境设施为SPF级(合格证号:SYXK (闽)2014-0005)。

1.2 主要试剂和仪器设备 巴戟天颗粒剂(江阴天江药业有限公司)，E2、OPG、RANKL酶联免疫吸附测试试剂盒(上海西唐公司)，AIR TECH无菌操作台(苏净集团安泰公司)，移液枪(Thermo labsystems公司)，64R低温高速离心机(美国Beckman公司)，Du650紫外分光光度计(美国Beckman公司)。

2 实验方法

2.1 分组与造模 对30只3月龄雌性SD大鼠，按随机分组原则分为假手术组、模型组、巴戟天高剂量、巴戟天中剂量组、巴戟天低剂量组，每组各6只，除假手术组外，其余24只手术切除双侧卵巢，进行骨质疏松的造模。具体步骤如下:用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，手术部位剪毛消毒，取腹部正中切口约1.5cm，切开皮肤、皮下组织、腹膜，拨开腹腔内脂肪，可见大鼠“Y”形子宫，沿子宫探及子宫末端左右双侧卵巢，行完全结扎切除术，逐层缝合，术后3天连续肌注青霉素预防感染；假手术组除未行卵巢结扎切除外，其余步骤与前同。

2.2 给药方法 本实验采用灌胃给药。巴戟天中剂量组用药剂量相当于临床等效剂量(人和动物体表面积折算等效剂量比率表)，即0.5g/100g(巴戟天颗粒/体重)溶于5mL蒸馏水灌注；巴戟天高剂量组用药剂量相当于临床等效剂量两倍，即1g/100g(巴戟天颗粒/体重)溶于5mL蒸馏水灌注；巴戟天低剂量组用药剂量相当于临床等效剂量0.5倍，即0.25g/100g(巴戟天颗粒/体重)溶于5mL蒸馏水灌注；假手术组用等量(5mL)生理盐水灌注。

2.3 取材与检测 连续灌胃12周后，处死大鼠，腹主动脉取血，离心取上清，采用酶联免疫吸附法检测血清E2、OPG以及RANKL含量。

3 实验结果

3.1 各组之间血清E2水平比较 假手术组血清E2水平较模型组升高(P<0.01),巴戟天治疗组各组E2水平随着剂量的增高而逐渐增高，其中巴戟天高剂量组血清E2水平较模型组升高(P<0.01),巴戟天中剂量组E2水平较模型组升高(P<0.05)，有统计学意义。

3.2 各组之间血清OPG,RANKL水平比较 假手术组血清OPG水平较模型组高(P<0.01)、RANKL水平较模型组低(P<0.01)。巴戟天高剂量组血清OPG水平与模型组相比升高(P<0.01)，而RANKL水平降低(P<0.01)巴戟天中剂量组血清OPG水平较模型组升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清E2、OPG、RANKL含量

注:与模型组相比，*P<0.05,**P<0.01。

4 讨论

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)，是一种高转换型骨质疏松症，是妇女更年期阶段最常见的骨代谢性疾病。研究表明，更年期女性原发性骨质疏松最主要的原因之一是由于雌激素的缺乏，造成骨吸收和骨形成的平衡失调[3]。

从实验结果可知，在切除卵巢后，假手术组雌激素水平显著高于模型组，巴戟天各剂量组雌激素水平均较模型组则升高,其中巴戟天高、中剂量组与模型组相比雌激素水平升高有统计学意义。显示巴戟天可能具有雌激素样作用，与之前一些学者的研究结果一致[4]。

随着OPG-RANK-RANKL轴的发现，骨质疏松的研究取得了突破性的进展[5]。目前已有多项研究表明，该轴对成骨细胞和破骨细胞具有调节作用，与骨代谢密切相关，并且可能是大多数激素与细胞因子发挥作用的最后通路[6]。雌激素可通过与成骨细胞内的雌激素受体结合，促进OPG的基因表达和蛋白合成[7]。

实验结果显示，巴戟天各剂量组OPG均较模型组高。其中巴戟天中、高剂量组与模型组相比,其血清OPG变化具有统计学意义。而巴戟天各剂量组RANKL均较模型组低，其中巴戟天高剂量组较模型组显著降低，有统计学意义。实验显示，巴戟天高剂量组能够提高血清OPG的水平，降低RANKL的水平，推测其对于成骨细胞分泌OPG有促进作用，但血清OPG水平易受多种因素影响，故仍需进一步的实验证实。

综上所述，巴戟天能够使骨质疏松大鼠血清雌激素水平升高，使OPG水平增高、RANKL水平降低。推测巴戟天具有类雌激素作用，能提高雌激素水平，通过影响OPG/RANK/RANKL轴，使成骨细胞OPG的合成和分泌增加，与RANKL竞争性结合,抑制RANKL与破骨细胞表面的RANK结合，从而抑制破骨细胞的功能活性，抑制骨吸收、促进骨形成，起到防治骨质疏松的作用。但本实验主要采用血清学指标，易受多种因素的综合影响，故有待进一步的实验研究。

[1]孔祥鹤,牛银波,李宇华,等.OPG/RANK/RANKL系统与骨质疏松研究最新进展[J].生命科学研究,2011;15(1):80-85.

[2]何剑全,陈健.巴戟天抗骨质疏松症作用机理的实验研究进展[J].世界中西医结合杂志,2010,5(6):546-548.

[3]Kousteni S,Chen JR,Bellido T,et al.Reversal of bone loss in mice by nongenotropic signaling of sex steroids[J].Science,2002,298(5594):843-846.

[4]王寅,张巧艳.巴戟天雌激素样作用的实验研究[J].时珍国医国药, 2011, 22(3):527-528.

[5]Lozo P,Krpan D,Krvavica A,et a1.Bone histology in postmenopausal osteoporosis-variations in cellular activity[J].Aet Med Croatica,2004.58(1):5-11.

[6]邹世恩,张绍芬.细胞因子在绝经后骨质疏松症发病机制中的作用[J].中国骨质疏松杂志,2012,18(4):375-380.

[7]Mone Z,Baljit SM,Li S,et a1.Understanding osteoclast formation and function:Implications for future Therapies for osteoporosis[J].Curr OpinOrthop,2003,14(5):341-350.