干扰SET8抑制血管平滑肌细胞转分化的研究

张东雪，高少辉，李同妙，周薇

血管钙化是导致心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）发病率与死亡率升高的关键环节和独立危险因素［1］。血管钙化不是一个被动的过程，而是由细胞介导的高度可调的过程［2］，其重要机制是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的成骨样表型转化。赖氨酸甲基转移酶SET8是现今发现唯一能够特异性单甲基化组蛋白H4赖氨酸第 20位赖氨酸（histone H4 lysine 20，H4K20）的甲基转移酶，参与调控细胞增殖、凋亡、细胞转移与分化等［3］。SET8 还可甲基化 TWIST、Wnt、P53等非组蛋白［4］，并通过调节转录过程影响相应基因的表达，进而调节细胞的转移与分化等。也有研究表明活化的Wnt信号通路可通过上调RUNX2的表达进而促进血管钙化［5］。但SET8在VSMCs转分化中的作用尚少见相关研究。为此，本研究以大鼠VSMCs为模型，观察SET8对大鼠VSMCs向成骨样细胞分化的影响。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各目的基因引物序列

1 材料与方法

1.1 实验动物 由河北医科大学动物实验中心提供的清洁级健康雄性SD大鼠8只（合格证编号：1305090），均为4周龄，体质量 80～120 g，平均体质量（95.7±6.5）g。

1.2 实验试剂及仪器 胎牛血清（fetal bovineserum，FBS）和DMEM（dulbecco’s modified eagle’s medium）培养基由美国GIBCO公司提供，SET8-短发夹RNA（shRNA）质粒及空质粒（NS-shRNA，广州复能基因有限公司），LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），碱性磷酸酶（ALP）活性试剂盒（中国Njjcbio公司），反转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（美国Thermo公司），PCR引物（上海捷瑞生物工程有限公司），RUNX2抗体和SET8抗体（英国Abcam公司），GAPDH抗体（美国Bioworld公司）。细胞培养箱（美国Sheldon公司），RT-PCR仪（美国Abi公司），倒置相差荧光显微镜（日本OLYMPUS公司），酶标仪（美国Biotek公司），凝胶成像系统（美国Proteinsimple公司），蛋白电泳仪（美国BIO-RAD公司）。

1.3 实验模型的制备与分组 采用组织块贴壁法培养原代大鼠胸主动脉VSMCs，具体操作为：采用2%戊巴比妥钠进行麻醉，75%乙醇浸泡，于生物安全柜中分离出胸主动脉，剥除内外膜，将中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，均匀铺满瓶底，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，48 h后更换新鲜培养基。之后每隔2 d换液，细胞融合80%～90%时进行传代。细胞传代培养至第3～4代时用于细胞实验。将细胞接种于适宜孔板中，融合率达80%时给予转染干预。转染方法为：参照脂质体LipofectamineTM2000说明书进行转染，在倒置荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白表达。实验分组为：（1）正常对照组：未转染组。（2）空质粒组：NS-shRNA质粒浓度为2µg/L、Lipo2000 为 4 µL/孔，转染 VSMCs。（3）SET8-shRNA 组：SET8-shRNA 质粒浓度为 2µg/L、Lipo2000为 4µL/孔，转染VSMCs。

1.4 RT-PCR测定VSMCs内SET8、RUNX2 mRNA的表达水平 采用RNA提取试剂提取转染后3组的mRNA并逆转录为cDNA。测定各组SET8与RUNX2的mRNA表达。实验重复3次。以各组cDNA为模板，GAPDH作为内参照。PCR引物由Primer 5.0软件设计，见表1。反应条件：GAPDH条件为95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，循环28次，继续72℃延伸10 min。RUNX2条件为95℃变性 30 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 40 s，循环 30次，继续72℃延伸10 min。SET8条件为95℃变性30 s，50℃退火40 s，72℃延伸40 s，循环38次，继续72℃延伸10 min。产物经质量浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳后，采集图像进行分析。

1.5 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测VSMCs内SET8、RUNX2蛋白的表达 采用蛋白提取试剂提取转染后3组的细胞总蛋白。应用BCA法测定蛋白浓度，煮沸变性后按每

孔总蛋白50µg加样，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电泳条件为95 V电泳1.5 h。之后用干转仪进行转膜，转膜时间为0.5 h。后放入5%的脱脂奶粉中于37℃恒温箱中封闭2 h。一抗4℃孵育过夜，一抗稀释比例分别为（GAPDH 1∶10 000，RUNX2 1∶500，SET8 1∶500）。次日洗膜，放入鼠二抗中（二抗稀释比例为1∶10 000），室温摇床孵育1 h，ECL显色并应用凝胶成像系统采集图像进行分析。实验重复3次。

1.6 ALP活性测定 细胞转染干预7 d后弃上清液，用PBS缓冲液洗2次，加适量质量浓度1%的TritonX⁃100溶液，4℃冰箱静置24 h，反复吹打细胞使其充分裂解，离心后弃沉淀物取上清液，按照ALP活性试剂盒说明书进行操作，应用酶联免疫吸附法于酶标仪520 nm波长处测定ALP的吸光度值，同时提取胞质蛋白，应用BCA法测定蛋白质的含量，用以校正ALP的活性（U/mg）。实验均重复3次。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SET8-shRNA对VSMCs SET8 mRNA和蛋白表达的影响 SET8-shRNA转染VSMCs 48 h后，荧光显微镜下观察转染效率为50%。RT-PCR和Western blot结果显示，SET8-shRNA组VSMCs细胞中SET8 mRNA和蛋白的表达水平均低于正常对照组和空质粒组（均P＜0.05），正常对照组与空质粒组比较差异无统计学意义，见图1。

2.2 SET8-shRNA对VSMCs RUNX2 mRNA和蛋白表达的影响 RT-PCR和Western blot结果显示，SET8-shRNA组RUNX2 mRNA和蛋白的相对表达量均低于正常对照组和空质粒组（均P＜0.05），正常对照组与空质粒组比较差异无统计学意义，见图2。

2.3 SET8-shRNA对VSMCs ALP活性的影响 与正常对照组和空质粒组比较，SET8-shRNA组ALP活性显著降低（均P＜0.05），正常对照组与空质粒组比较差异无统计学意义，见图3。

Fig.1 The influence of SET8-shRNA on VSMCs of SET8 expression图1 SET8-shRNA对VSMCs SET8表达的影响

Fig.2 The influence of SET8-shRNA of RUNX2expression on the VSMCs图2SET8-shRNA对VSMCs RUNX2表达的影响

Fig.3 The changes of alkaline phosphatase activity in VSMCs图3 VSMCs各组ALP活性的变化

3 讨论

血管钙化在心血管疾病患者中普遍存在，主要表现在中膜钙化，且与心血管事件的发生密切相关，而VSMCs是血管中膜的主要组成成分，是血管中膜发生钙化的结构基础［6-7］。VSMCs向成骨样转化是血管钙化的重要机制之一［8］。Quarles［2］研究发现，中膜钙化是一个主动的、受细胞和基因调控的、似成骨形成的过程，其特性为成骨样分化。因此，抑制VSMCs的转分化是减少血管钙化的关键。SET8在肿瘤中发现具有促进上皮细胞间充质转分化的作用［9］。鉴于此，本研究通过干扰大鼠VSMCs SET8的基因表达，发现SET8可明显抑制大鼠VSMCs RUNX2 mRNA和蛋白的表达，提示SET8可能参与了大鼠VSMCs向成骨样细胞转分化的过程。

Linscott等［10］研究发现 SET8 能够特异性单甲基化组蛋白H4K20，能招募特异的调节蛋白，在细胞内具有调控组蛋白修饰、调节染色质结构和基因转录、调控细胞周期等作用，其主要参与细胞增殖、细胞转移分化等多种细胞生理功能。RUNX2是转录因子runt家族成员之一，是调控间充质干细胞向成骨、软骨转化所必需的核心转录因子，在细胞的表型转化中发挥重要作用［11］。有研究表明SET8作为共刺激因子参与了Wnt调控靶蛋白RUNX2表达的作用，进而调节VSMCs的表型转化［12-14］。为了证实SET8是否与VSMCs的表型转化直接相关，本研究通过对 VSMCs进行转染空质粒（NS-shRNA）和SET8-shRNA质粒，结果显示正常对照组与空质粒组比较RUNX2表达水平无明显变化，说明VSMCs转染质粒对RUNX2表达无明显影响。而SET8-shRNA组RUNX2表达水平均显著低于正常对照组和空质粒组，提示干扰SET8基因表达可抑制VSMCs向成骨、成软骨细胞表型转化。ALP活性与成骨细胞的活性及成骨作用有关，也是VSMCs表型转化的早期指标［15］。本研究结果显示，与正常对照组和空质粒组比较，SET8-shRNA组ALP活性显著降低，正常对照组与空质粒组无明显差异，进一步提示干扰SET8基因表达可抑制VSMCs向成骨、成软骨细胞表型转化。

综上所述，SET8-shRNA可有效抑制VSMCs中SET8的表达。干扰SET8基因表达可有效降低大鼠VSMCs RUNX2表达水平以及ALP活性，进而抑制其表型转化。本研究仅在细胞实验中发现了干扰SET8可抑制VSMCs向成骨、成软骨细胞表型转化的现象，其影响VSMCs表型转化的具体机制仍需进一步研究验证。

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