叉柱花的组织培养技术探究

潘维强 谢德欢 彭小倩

摘 要 采用MS培养基进行叉柱花茎尖组织培养繁殖，建立叉柱花的快速繁殖体系。通过在培养基中添加不同浓度的NAA和6-BA，实验结果显示培养基配方MS培养基+2 mg·L-1 6-BA+1 mg·L-1 NAA最利于叉柱花的生长。该研究初步探索叉柱花组织培养繁殖的新方法，可以有效提高叉柱花的繁殖速率，缩短叉柱花的上市时间，有效补充市场缺口，能够为市场提供品质优良的无菌观赏水草。

关键词 南美叉柱花；组织培养；快速繁殖；无菌观赏水草

中图分类号：S567.23 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.09.076

观赏水草是水族缸造景中必不可少的原材料，随着观赏水族的快速发展，观赏水草的需求量越来越大，各种水草繁殖培育技术亟待创新[1-2]。南美叉柱花（Staurogyne repens），通常称作叉柱花，属爵床科、叉柱花属，是一种双子叶植物，原产于巴西、委内瑞拉等地，为挺水性水草。南美叉柱花的水上草与水中草外观基本相同，主要的区别就是水中草比水上草而定叶片狭小。水中草的叶片呈翠绿色，十字对生，披针形。茎呈偏棕绿色，整体高度不超过10 cm。叉柱花是近几年才引入我国的一种水草，由于其生长速度慢、植株矮、外观漂亮，常用作水族缸造景中的前景草，深受人们的喜爱，市场需求火热，供不应求。叉柱花的繁殖主要依靠成体匍匐茎的分株，繁殖速率低，成本高。叉柱花属短日照植物，在每年11月以后常常开花，引起植物早衰，叶片枯黄，失去观赏价值，不仅导致经济价值下降，还会引起秋冬季节市场供应短缺。随着生物技术的发展，植物组织培养技术日趋成熟，已经应用到了许多花卉、果树等的苗种繁育，并且实现工厂化生产[3]，如樱花[4-5]、彩色马蹄

莲[5]、香石竹[5]、金边凤梨[6]、网纹草[7-8]等。近年来，一些观赏水草的生产繁育也成功的运用了组织培养技术，并且优点明显，如红柳[9]、大水榕[10-11]、小卷浪[12]、珍珠草[12]、长叶皇冠[13]等，有些已经实现工厂化生产，但还没有叉柱花工厂化生产的报道。组织培养技术能够快速繁殖叉柱花，在較短的时间内获得大量的叉柱花苗种，并且在室内光照和温度恒定的状态下培育，没有明显的季节变化，避免了光照周期变化而引起的开花[14-15]。此外，利用组织培养技术繁殖的叉柱花在无菌环境培育而成，经过优选、脱毒、无菌培育等工序，全程都在无菌环境下，无病菌侵扰，也没有藻类、害虫滋生，可塑性强[16]。这就意味着，相比传统的水上叶和水下叶水草，叉柱花不会给水族缸带入病菌，藻类等，可以有效的避免观赏鱼疾病和水族馆爆藻。利用组织培养技术培养的叉柱花具有超长的保鲜时间。无菌的培养环境，特殊的营养基质，使水草能在杯内存活很长时间，所以在长距离运输、耐保存方面明显优于水上叶和水下叶的水草。此外，组织培养繁殖的叉柱花适应能力强，转水快，不易溶叶。本研究通过对叉柱花组织培养技术的探索，以期为叉柱花的工厂化快速繁育提供技术方案，提高市场供应量。

1 材料与方法

1.1 材料

2016年10月采自蠡园实验室自然繁育的水上叶的叉柱花，选用植株粗壮、健康的成品叉柱花作为外植体。

1.2 实验方法

采用无蔗糖的MS培养基，在其中添加适量的NAA、6-BA以及30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1琼脂，pH值调至5.8±0.2，经高压灭菌锅121 ℃高压灭菌20 min。培养条件：日温26 ℃，夜温22 ℃，湿度65%～80%，光照强度为2 000 lx，光照时间10 h/d。

1.3 外植体的消毒和灭菌

选取叉柱花幼嫩的带腋芽的茎段作为外植体，剪去叶片，用自来水流水冲洗1 min，然后在培养皿中将材料浸泡在煮沸冷却的水中，用毛笔刷洗，重复3次，每次更换水。再用淡肥皂水浸泡10 min，取出，用自来水冲洗

1 min，然后转移至超净工作台中，用75%酒精在无菌烧杯中浸泡外植体6～10 s，再用0.1%升汞消毒9 min，浸泡时不断的摇晃外植体，以避免外植体上有气泡的产生，接着用无菌水冲洗6次，得到无菌外植体备用。

1.4 建立叉柱花无菌体系

配制6个NAA+6-BA组合不同浓度的培养基，用锥形瓶盛装，每个类型4瓶，共24瓶，激素浓度组合分为6种，编号为1～6，6-BA∶NAA（mg·L-1）浓度分别为0.5∶0.1、1∶0.1、2∶0.1、0.5∶0.2、1∶0.2、2∶0.2。把消毒好的外植体切成带腋芽小段，接种至培养基，进行诱导生长，经过15 d的生长后获得无菌苗，通过观察幼苗的生长状态初步确定其激素最适浓度配比。

1.5 叉柱花的扩繁

将获得的无菌苗拆成单株幼芽接种至新配培养基中确定NAA+6-BA的最适配比。配制4种培养基，编号1～4，使用锥形瓶盛装，每种4瓶，激素浓度组合NAA∶6-BA（mg·L-1）分别为0.2∶1、0.5∶1、1∶1、1.5∶1。经过20 d的生长，比对生长状态。

1.6 叉柱花的移植

当恒温培养箱中叉柱花幼苗长至苗高2 cm、根1 cm时，便可移出培养箱，在室内炼苗培养7 d，即可转入传统水草培养基质培养生产。

2 结果与分析

2.1 无菌体系的建立与诱芽

无菌体系一旦建立，便可通过扩繁不断的继代增殖培养，在短时间内获得大量的无菌苗，如图1所示。在建立无菌体系的过程中，设定梯度较大的6-BA，而NAA只有两个浓度，从实验结果可以看出植株根系都不发达，而植株不定芽的生长状态随着6-BA浓度的增加而表现的愈加良好，但是随着浓度增加，不定芽的密度过密不利于后期实验操作，所以选定1mg/L的浓度作为最适添加浓度。

无菌体系培养过程中，编号1培养基芽较少、粗壮，根很少、细小；编号2培养基芽较多、均匀，根很少、细小；编号3培养基芽多、较短、密集，根很少、细小；编号4培养基芽较少、粗壮，根很少、短小；编号5培养基芽较多、均匀，根很少、短小；编号6培养基芽多、较短、密集，根很少、短小。

2.2 叉柱花的扩繁与生根培养

将无菌体系获得的植株直接分株接入新制培养基，培养14 d后，观察生根情况，如图2所示。结果显示0.2～1.5 mg·L-1浓度的NAA都能诱导生根，但是差别很大，0.2 mg·L-1浓度的根生长情况很差，根数目少而短小，而0.5 mg·L-1条件下的均匀，数目较多，长度适中，随着浓度的增加，1～1.5 mg·L-1根生长的长度越来越长，数目也有所增加。所以结果显示0.5 mg·L-1时的NAA浓度最合适。

2.3 无菌苗的分炼和移栽

掌握NAA+6-BA最佳组合添加浓度后，后续扩繁生产都使用0.5 mg·L-1 NAA+1 mg·L-1 6-BA的添加量配置的培养基，培养14 d左右，叉柱花幼苗一般株高2 cm，根长1 cm，此时可以移栽到室内，经过7 d左右的生长，可上市。或者分炼移栽至准备好的特制无菌水草杯，制成无菌杯草，同样培养7 d左右可上市。

3 讨论

国内观赏水草多引自国外，大多数来自南美洲、非洲、东南亚等热带地区[17]。观赏水草需求量越来越大，已发展为一种重要的产业，但许多水草繁育难度大、要求高。广东省广州市是我国进口水草的最大集散地，同时广东省也是国内最大的观赏水草产地，得益于得天独厚的气候条件，热带水草能够在这里繁育，而在北方，水草产量较低[18]。因此天然条件对水草生产有着很大的影响。运用组织培养技术则可以开发出更多种类的水草繁育方法，恒定的培养条件可以解除地域对水草生产的限制。恒定的环境条件还可以有效的改变水草生长周期，对叉柱花来说，可以防止它冬天开花现象的出现，从而消除季节性的供应，可以长期连续的对市场提供叉柱花。组织培养技术可以相对缩短叉柱花生产周期，快速获得成品植株，对提高上市产量有着重要意义。现在的组织培养技术非常成熟，只是生产成本关系到它的应用范围。在组织培养快速繁殖技术中，建立无菌体系和增殖效率是关键，植物外植体通常包含有许多内生和外生细菌，在培养过程中无菌材料尤为关键。要严格把控外植体在个处理步骤中的处理时间，不宜过长或过短，处理时间过短则有可能除菌效果差，处理时间过长又可能导致外植体活性变差，影响培养生长[12]。本研究通过设置简单的梯度获得适合的NAA+6-BA组合，两种激素成本较低，效果理想，完全适合叉柱花的快速繁殖生产。将培养基盛入定制的水草杯中，在后期分炼移栽中可以生产出无菌叉柱花，直接上市，这种无菌水草发展前景十分良好，在未来无菌水草很有可能代替一部分传统方法繁育的水草，对观赏水草行业的发展具有重大意义。

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（责任编辑：赵中正）