2株楚雄腮扁叶蜂虫生真菌培养条件及产孢特性研究

2018-04-25曾廷潇芦俊佳樊佳星李永和

西南林业大学学报 2018年2期

曾廷潇芦俊佳徐荣樊佳星李永和,2

(1. 西南林业大学生物多样性保护与利用学院，云南昆明 650224；2. 西南林业大学云南生物多样性研究院，云南昆明 650224)

楚雄腮扁叶蜂 (Cephlicachuxiongica) 隶属于膜翅目 (Hymenoptera)，扁叶蜂科 (Pamphiliidae)，腮扁叶蜂属 (Cephalcia)[1]，它以幼虫危害云南松 (Pinusyunnanensis)、华山松 (P.armandii) 等树种的针叶，2年1代 (云南省广南县1年1代)，滞育时间达21个月[2-3]。幼虫取食量大，危害严重，林木受害后形似火烧，严重影响林木的生长势，造成树势衰弱，进而引起林木次生病虫害的发生。该虫自1984年首次报道以来，先后在云南和四川多地发生，截至2012年，该虫在全国22个县市发生危害，其中云南省发生最多[4]，已成为云南省重大林业有害生物。楚雄腮扁叶蜂因其繁殖能力强、虫口密度大、扩散蔓延速度快、生活隐蔽而易于爆发成灾，防治难度极大，目前主要采取物理防治和化学农药防治[5-7]。物理防治采用人工摘除带卵松针、幼虫取食形成的巢幕进行集中烧毁，翻挖受害林地以减少越冬越夏虫口数，化学防治则根据不同虫期喷施吡虫啉粉剂、90%杜邦万灵可湿性粉剂、川宝1号粉剂、林得保粉剂、护林神粉剂等进行防治[2,6-7]。然而物理防治费时费力，防治成本较高；化学防治污染环境，害虫容易产生抗药性，只能治标不能治本，故利用虫生真菌对楚雄腮扁叶蜂进行生物防治应是最有效的防治措施。2015年夏举飞首次对楚雄腮扁叶蜂虫生真菌进行研究报道[8]，由于虫生真菌对楚雄腮扁叶蜂的防治效果受到环境因子的影响[9]，只有掌握最有利于虫生真菌的生长条件及产孢特性，才能为有效利用其防治楚雄腮扁叶蜂提供理论依据，所以，本实验对楚雄腮扁叶蜂2株高致病力菌株的培养条件及产孢特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1供试菌株

NH512菌株和Y512菌株从入土后自然罹病死亡的楚雄腮扁叶蜂幼虫体表分离得到，通过形态学和分子生物学方法鉴定为粉质棒束孢 (Isariafarinosa)，保存于西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室。

1.1.2供试培养基

SDAY培养基：蛋白胨10 g、酵母浸出物10 g、葡萄糖40 g、琼脂18 g、蒸馏水1 L。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、蒸馏水1 L。

1.2 实验方法

将供试菌株在PDA培养基上培养10 d备用。

以SDAY培养基为基础培养基，用直径为5 mm的打孔器在上述PDA培养基中打出菌块，然后分别接入事先倒好SDAY培养基的90 mm平板中。

1.2.1温度对菌株生长和产孢的影响实验

分别将接入菌块的培养皿置于10、15、20、25、30、35 ℃的恒温培养箱中，每个处理3次重复。培养15 d，期间每隔2 d采用十字交叉法测量其菌落直径，并计算平均菌落直径和平均产孢量[10-11]，菌落的产孢量按下式计算：

每1 cm2菌落含孢量或菌落产孢量=(平均小格孢子数 × 4 × 106× 稀释倍数)/(3.14 × 0.252)[12]。

1.2.2光照对菌株生长和产孢的影响实验

分别将接入菌块的培养皿置于25 ℃全光照、黑暗-光照12 h交替、全黑暗的培养箱中；培养15 d，期间每隔2 d测量1次菌落直径和产孢量，每个处理3次重复[10-12]，菌落产孢量计算方法同1.2.1。

1.2.3紫外线诱导对菌株生长和产孢的影响实验

分别将菌株置于紫外灯下照射30 min后移入25 ℃的培养箱中培养15 d，未经紫外灯照射的处理作为对照；期间每隔2 d测量1次菌落直径和产孢量，每个处理3次重复[10,13]，菌落产孢量计算方法同1.2.1。

采用Duncan′s 新复极差法对数据进行统计分析。

2 结果与分析

现将不同条件下培养15 d时NH512菌株、Y512菌株的菌落直径和累计产孢量，统计结果见表1。

2.1 温度对菌株生长及产孢的影响

2.1.1温度对NH512菌株生长及产孢的影响

温度对NH512菌株菌丝生长有影响，25 ℃是菌丝生长的最适温度，见图1。NH512菌株在10～35 ℃范围内菌丝均能生长，10～25 ℃期间，随着温度升高，菌丝生长加快，25 ℃时菌落直径最大，达到48.15 mm；超过25 ℃后生长减缓，35 ℃下该菌株菌丝生长最慢。20 ℃和25 ℃条件下培养15 d的菌落直径分别为46.78、48.15 mm，明显大于其他温度下的菌落直径，且差异显著；35 ℃下菌落直径最小，为5.96 mm。

表1不同培养条件下两个菌株的生长及累计产孢情况
Table 1 The accumulation of spores and growth of 2 strains under different culture conditions

培养条件菌落直径/mmNH512Y512累计产孢量/(×107个/cm2)NH512Y512温度/℃1020 65±0 5615 78±0 160 820±0 0600 455±0 1601534 59±0 2924 35±0 451 691±0 0800 715±0 1202046 78±0 4164 20±0 285 886±0 1002 417±0 8802548 15±0 5245 97±0 549 184±0 1603 091±0 7303020 13±0 8523 38±0 780 396±0 1000 383±0 180355 96±0 737 30±0 310 060±0 0600 000±0 000光照黑暗-光照12h交替40 10±0 3644 40±0 274 726±0 2289 038±0 024全光照37 45±0 7631 51±0 763 430±0 4512 830±0 212无光照38 51±0 3142 72±0 589 184±0 1603 091±0 730紫外线经紫外线诱导42 45±0 3137 56±0 698 800±0 42015 690±0 810未经紫外线诱导35 67±0 5946 72±0 599 184±0 1603 091±0 730

图1温度对NH512菌株菌落直径的影响
Fig.1 The changes of the colony diameter of the strains NH512 under different temperatures conditions

温度对NH512菌株产孢量有影响，25 ℃是该菌株的最适产孢温度，见图2。接种后第3天，只有10 ℃温度下的菌株开始产孢；第15天时，所设温度梯度下的菌株均能产孢。10～25 ℃之间，随着温度的增加，菌株的累计产孢量逐渐升高，累计产孢量从10 ℃时的0.820 × 107个/cm2增加到25 ℃时的9.184 × 107个/cm2；温度高于25 ℃以后，菌株累计产孢量开始下降，35 ℃时菌株累计产孢量仅为0.06 × 107个/cm2。

图2温度对NH512菌株累计产孢量的影响
Fig.2 The changes of the accumulation of spores of the strains NH512 under different temperatures conditions

2.1.2温度对Y512菌株生长及产孢的影响

温度对Y512菌株菌丝生长有影响，20 ℃是菌丝生长的最适温度，见图3。Y512菌株在 10～35 ℃范围内菌丝均能生长，10～20 ℃期间，随着温度升高菌丝生长加快，20 ℃时菌株直径最大，达到64.20 mm； 20 ℃后生长逐渐减缓，35 ℃时该菌株菌丝生长最慢，菌落直径仅为7.30 mm。20 ℃和25 ℃条件下培养15 d的菌落直径分别为64.20、45.97 mm，明显大于其他温度下的菌落直径，且差异显著；35 ℃下菌落直径最小，为7.30 mm。

图3温度对Y512菌株菌落直径的影响
Fig.3 The changes of the colony diameter of the strains Y512 under different temperatures conditions

温度对Y512菌株产孢量有影响，25 ℃是该菌株的最适产孢温度，见图4。10～30 ℃范围内该菌株都能产孢，到35 ℃时不能产孢。10～30 ℃范围内该菌株的产孢起始温度不同，但从第9天开始，产孢量出现较大差异。10～25 ℃之间，随着温度的增加，菌株的累计产孢量逐渐升高，累计产孢量从10 ℃时的0.455 × 107个/cm2增加到25 ℃时的3.091 × 107个/cm2；温度25 ℃以后，菌株累计产孢量开始下降，35 ℃时菌株已不能产孢。

图4温度对Y512菌株累计产孢量的影响
Fig.4 The changes of the accumulation of spores of the strains Y512 under different temperatures conditions

2.2 光照对菌株生长及产孢的影响

2.2.1光照对NH512菌株生长及产孢的影响

光照条件对NH512菌株菌丝生长有影响，黑暗-光照条件最有利于菌丝生长，见图5。NH512菌株在无光照、黑暗-光照12 h交替及全光照条件下均能生长，培养15 d时，无光照和黑暗-光照12 h交替条件下菌株生长较快，平均菌落直径分别为38.51、40.10 mm；全光照条件下菌株生长最慢，平均菌落直径为37.45 mm。

图5光照对NH512菌株菌落直径的影响
Fig.5 The changes of the colony diameter of the strains NH512 under different light conditions

从图6可看出：光照条件对NH512菌株产孢量有影响，无光照条件下最适宜于NH512菌株产孢。无光照、黑暗-光照12 h交替及全光照条件下，第3天均开始产孢，直到第12天，3种条件下菌株的累计产孢量差异不大；第12天开始，3种条件下的产孢量均开始增加，但无光照条件下菌株的产孢量急剧增加，到第15天时的累计产孢量达到9.184 × 107个/cm2，而黑暗-光照12 h交替、全光照条件下的累计产孢量分别为4.726 × 107、3.430 × 107个/cm2。

图6光照对NH512菌株累计产孢量的影响
Fig.6 The changes of the accumulation of spores of the strains NH512 under different light conditions

2.2.2光照对Y512菌株生长及产孢的影响

光照条件对Y512菌株菌丝生长有影响，黑暗-光照12 h交替条件最有利于菌丝生长，见图7。Y512菌株在无光照、黑暗-光照12 h交替及全光照条件下均能生长，培养15 d时，无光照和黑暗-光照12 h交替条件下菌株生长差异不明显，平均菌落直径分别为42.72、44.40 mm；全光照条件下菌株生长最慢，平均菌落直径为31.51 mm。

图7光照对Y512菌株菌落直径的影响
Fig.7 The changes of the colony diameter of the strains Y512 under different light conditions

光照条件对Y512菌株产孢量有影响，黑暗-光照12 h交替条件下最适宜于Y512菌株产孢，见图8。无光照、黑暗-光照12 h交替及全光照条件下，到第9天，3种条件下菌株的累计产孢量差异不大；第9天开始，黑暗-光照12 h交替条件下菌株的产孢量急剧增加，到第15天时的累计产孢量达到9.038 × 107个/cm2，而无光照、全光照条件下的累计产孢量增速较缓，到第15天时的累计产孢量分别为3.091 × 107、2.83 × 107个/cm2。

2.3 紫外线诱导对菌株生长及产孢的影响

2.3.1紫外线诱导对NH512菌株生长及产孢的影响

紫外线诱导对NH512菌株菌丝生长有影响，能够加快NH512菌株菌丝的生长，见图9。接种后第12天前，经紫外线诱导的NH512菌株菌落直径增速比未经紫外线诱导的快；第12天时，两者的菌落直径几乎相等；第12 d后,经紫外线诱导的菌株菌丝生长加快，到第15天时，经紫外线诱导后该菌株的菌落直径比未经紫外线诱导大，分别为42.45、35.67 mm，两者间差异明显。

图8光照对Y512菌株累计产孢量的影响
Fig.8 The changes of the accumulation of spores of the strains Y512 under different light conditions

图9紫外线诱导NH512菌株菌落直径的影响
Fig.9 The effect of ultraviolet mutagenesis on the colony diameter of the strains NH512

从图10可以看出：紫外线诱导对NH512菌株累计产孢量影响不大，仅是影响产孢的进度。第3～6天，经紫外线诱导的菌株产孢量增速较快，未经紫外线照射的菌株产孢量增速较慢；第6～12天，经紫外线诱导的菌株产孢量增速减缓，未经紫外线照射的菌株产孢量增速加快，到12 d时两者的累计产孢量基本相等；12～15 d，经紫外线诱导和未经紫外线照射的菌株产孢量增速基本一致，故第15天，它们的累计产孢量相差无几，分别为8.8 × 107、9.184 × 107个/cm2。

2.3.2紫外线诱导对Y512菌株生长及产孢的影响

从图11可以看出：紫外线诱导能抑制Y512菌株的菌落生长。接种后前6 d，经紫外线诱导后的菌落直径高于未经紫外线诱导的菌落直径，第6天时，经紫外线诱导和未经诱导的菌落直径几乎一致，分别为20.68、20.58 mm；第6天后，未经紫外线诱导的菌落直径生长速度明显高于经紫外线诱导的菌落直径，到15 d时，未经紫外线诱导的菌落直径达到46.72 mm，经紫外线诱导的菌落直径则为37.56 mm。

图10紫外线诱导对NH512菌株累计产孢量的影响
Fig.10 The effect of ultraviolet mutagenesis on the accumulation of spores of the strains NH512

图11紫外线诱导对Y512菌株菌落直径的影响
Fig.11 The effect of ultraviolet mutagenesis on the colony diameter of the strains Y512

从图12可以看出：紫外线诱导能极大促进Y512菌株产孢。经紫外线诱导后该菌株在培养的第3天已开始产孢，而未经紫外线诱导的则未产孢；接种后3～6 d经紫外线诱导的产孢量增长缓慢，6 d后产孢量增加的速度逐渐加快，12 d后产孢量急剧增加，到第15天时产孢量达到15.69 × 107个/cm2；而未经紫外线诱导的菌株，9 d以前产孢量均较少，第9天产孢量缓慢增加，到第15天时产孢量仅为3.091 × 107个/cm2。

图12紫外线诱导对Y512菌株累计产孢量的影响
Fig.12 The effect of ultraviolet mutagenesis on the accumulation of spores of the strains Y512

3 结论与讨论

粉质棒束孢又叫虫花、粉质拟青霉[14]，该菌毒力强，寄主范围广，是一种世界分布广泛且具有良好生防效果的土壤习居真菌，它能侵染鳞翅目 (Lepidoptera)、鞘翅目 (Coleoptera)、膜翅目 (Hymenoptera) 等多个目的昆虫[15-18]。在人们的生产和生活中它都充当着不可或缺的角色，如研制抗肿瘤和增强免疫力的药物以及作为生防菌等，它的应用前景很广阔[19-22]。

前人通过大量研究认为粉质棒束孢作为生防菌可以用来防治多个目的昆虫，如黄刺蛾幼虫 (Cnidocampaflavescens)、菜青虫 (Pierisrapae)、柑橘全爪螨 (Panonchuscitri) 等[22-33]，但对其生物学特性研究不够[16-17,34-39]，导致防治实践中未达到预期的防治效果。本研究结果表明，黑暗-光照12 h交替条件可以促进NH512菌株和Y512菌株菌丝生长，无光照条件有利于NH512菌株产孢，而黑暗-光照12 h交替条件能促进Y512菌株产孢。紫外线诱导能促进NH512菌株的菌丝生长，抑制Y512菌株的菌丝生长；紫外线诱导能抑制NH512菌株产孢，而紫外线诱导能大大促进Y512菌株产孢。

前人研究报道20～25 ℃是粉质棒束孢菌丝生长的适宜温度，光照对菌丝生长和产孢都有一定的影响[35]，14～18 ℃是生产的最适宜温度[36]。本研究表明， NH512菌株和Y512菌株在10～30 ℃之间都能生长，适宜菌丝生长的温度在20～25 ℃之间，25 ℃为NH512菌株菌丝的最适生长温度，而Y512菌株菌丝生长的最适温度为20 ℃，这一研究结果与汪章勋的研究结果相符[37]。孙洒洒研究发现，25 ℃比较有利于虫花 (Isariafarinosa) CH7菌丝生长[40]，因此不同菌株最适宜其菌丝生长的温度可能不同。35 ℃时Y512菌株的菌丝生长变缓慢，NH512菌株则停止生长，这与安建梅的研究结果一致[35]，不同菌株间菌丝耐高温程度不同。本研究发现，在同一温度下NH512菌株的累计产孢量均比Y512菌株的高，因此NH512菌株应用于防治实践的潜力比Y512菌株大。冯玉云的研究表明，当温度超过20 ℃时，粉质棒束孢处于活跃状态，菌丝生长速度快，老化衰退的速度也快[41]。本研究的2个菌株是否也存在菌丝老化衰退速度快的情况需进行下一步研究。

致谢：本研究依托西南林业大学云南生物多样性研究院科研实验平台完成。

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