ICU患者艰难梭菌分离培养与流行病学特征研究

曾勇彬，刘安超，李武，唐尧，赖毅真，叶思琪，林晓，林建东，林宇岚，杨滨

1.福建医科大学附属第一医院，福建 福州 350005；2.福建医科大学医学技术与工程学院，福建 福州 350005

艰难梭菌(Clostridiumdifficile，CD)是一种革兰阳性、专性厌氧的粗大芽孢杆菌，于1935年由Hall和O′Toole首次从健康新生儿粪便中分离[1]。艰难梭菌分布广泛，可在健康人胃肠道定植，是一种条件致病菌，经粪-口传播，也是院内获得性肠道感染及抗生素相关性腹泻(antibiotic associated diarrhea，AAD)的主要病原菌。艰难梭菌包括产毒株和非产毒株两种：非产毒株无致病性；产毒株可产生A、B两种主要的致病毒素(分别由tcdA和tcdB基因编码)，少数可产生二元毒素[2-3]。

当肠道微生态平衡遭到破坏(如滥用/长期使用抗生素、免疫抑制剂、质子泵抑制剂、化疗药物等)时，肠道正常菌群受到抑制，艰难梭菌大量生长，可造成艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection，CDI)和艰难梭菌相关性腹泻(Clostridiumdifficileassociated diarrhea，CDAD)，轻者表现为自限性腹泻，重者可出现伪膜性肠炎，中毒性巨结肠，甚至死亡[4]。近几年来，全球范围内CDI的发生率和病死率日益增加，在欧洲和北美已有多次暴发流行，引起世界各国的广泛关注，预防艰难梭菌感染显然成为医院感染控制的新挑战[3]。

研究发现，CDI的高危因素包括广谱抗生素的使用、老龄、长时间住院、免疫系统缺陷、化学治疗、严重的基础疾病、应用质子泵抑制剂、应用H2受体抑制剂和应用糖皮质激素等[5-6]。ICU患者由于病情比较危重、基础疾病相对较多，部分病人需联合应用抗生素以及有可能长期住院，极有可能增加CDI的发生风险，甚至暴发流行，这对ICU患者来说可能是致命的[7]。本研究针对我院ICU住院时间>7 d的患者，调查艰难梭菌定植/感染情况，为了解艰难梭菌的流行情况，开展艰难梭菌的治疗和控制提供参考。

1 对象与方法

1.1标本收集 选择2016年9月至2017年6月福建医科大学附属第一医院ICU住院时间>7 d的139例患者为研究对象，收集粪便样本，采集患者新鲜粪便3～5 g(若是液状粪便，采集2～3 mL)，装于清洁的不含防腐剂的粪便采集管中。

1.2临床资料收集 通过查阅病历系统收集临床资料，包括患者年龄、性别、入院时间、临床诊断、所用抗生素类型、所用抗生素的先后顺序、所用抗生素的持续时间、白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)等以及质子泵抑制剂(PPI)、组胺受体抑制剂、激素等药物使用情况。艰难梭菌定植(Clostridiumdifficilecolonization，CDC)是指艰难梭菌培养阳性，但患者未出现腹泻症状；艰难梭菌感染(CDI)定义为患者出现腹泻同时产毒艰难梭菌培养阳性；腹泻定义为24 h内出现3次以上不成形便。

1.3试剂与仪器 ABI梯度PCR仪(VeritiTM96，美国Life Technologies公司)、台式离心机(德国Eppendorf公司)、电子天平(德国Sartorius公司)、DYY-7C型电泳仪(北京六一仪器厂)、NanoDrop 2000微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher 公司)、GENbag厌氧产气袋和艰难梭菌鉴定平板(法国生物梅里埃公司)、布鲁克MALDI Biotyper质谱仪(美国布鲁克 道尔顿公司)、2×PCR MasterMix(大连宝生物工程有限公司)、细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司)、艰难梭菌毒素A & B检测试剂盒(美国TechLab公司)。

1.4厌氧培养与质谱鉴定 取适量粪便标本与等体积无水乙醇振荡混匀，室温静置60 min，3 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀物分区划线接种于艰难梭菌选择性培养基CDIF(法国生物梅里埃公司)，35℃厌氧培养48 h。艰难梭菌在CDIF培养基上生长呈黑色菌落。挑取典型菌落2～3个/平板，使用布鲁克MALDI Biotyper质谱仪进行可疑艰难梭菌的鉴定。质谱仪线性正性模式频率为60 Hz，采集分子量为2 000～20 000的蛋白质图谱。每一个样本的蛋白质谱在不同位置经过200次的激光点击而获得，采集到的特征性蛋白质峰信息通过软件校正，然后与仪器内的微生物数据库图谱进行比对分析，最终获得鉴定结果。

1.5艰难梭菌毒素A & B表型检测 采用艰难梭菌毒素A&B检测试剂盒(美国TechLab公司)对质谱仪鉴定的阳性菌株进行毒素表型检测。

1.6艰难梭菌毒素基因检测 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取艰难梭菌DNA。用Primer Premier 5.0软件设计毒素基因扩增引物(包括tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，见表1)。PCR反应体系25 μL，包括2×PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物各0.7 μL、细菌模板2.0 μL、ddH2O 9.1 μL。PCR反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，共40个循环；72℃延伸5 min。取10 μL PCR产物，在2.0%琼脂糖凝胶上电泳(120 V、90 mA、45 min)，观察结果。

表1 艰难梭菌毒素基因PCR引物序列

2 结 果

2.1ICU艰难梭菌定植与非定植患者相关因素比较 由表2可见，高龄、长时间住院、高淋巴细胞数、使用β-内酰胺类抗生素是艰难梭菌定值的高危因素。

2.2ICU患者艰难梭菌定植危险因素分析 Logistic多因素分析结果显示，使用β-内酰胺类药物为ICU患者发生艰难梭菌定植的独立危险因素(OR=3.881，P=0.039)，见表3。

2.3艰难梭菌菌落形态与典型质谱峰图 如图1A所示，艰难梭菌在CDIF显色培养基上生长呈典型的黑色菌落。艰难梭菌的特征性蛋白质质谱图见图1B，其质荷比分布为2 000～12 000；峰的相对强度为(0.1～1.9)×104。

表2 ICU艰难梭菌定植和非定植患者相关因素比较

表3 ICU患者艰难梭菌定植危险因素的Logistic分析

A：艰难梭菌在CDIF培养基上呈典型的黑色菌落(黑色箭头所指)；B：标准条件下艰难梭菌特征质谱图(横坐标为质荷比，纵坐标为峰相对强度)

图1艰难梭菌在CDIF培养基上的菌落形态和特征性质谱峰图

2.4分子流行病学特征

2.4.1艰难梭菌毒素A&B表型检测 共检出24株艰难梭菌，其中仅有1株为A&B毒素表型阳性，占4.2%，其余23株均未检出A&B毒素，占95.8%。

2.4.2艰难梭菌毒素基因检测 24株艰难梭菌中，14株艰难梭菌的tcdA和tcdB基因检测阳性，占58.3%；有10株为tcdA/tcdB基因检测阴性，占41.7%；所有菌株二元毒素基因(ctdA/ctdB)均未检出。见图2。

注：泳道1为DNA标准条带；泳道2、3、4、5、6为tcdA；泳道7、8、9、10、11为tcdB。

图2艰难梭菌毒素A和毒素B基因PCR产物电泳结果

3 讨 论

3.1艰难梭菌感染的现状 随着广谱抗生素的大量使用、人口老龄化的加速、住院时间的延长，艰难梭菌感染已成为住院患者特别是高风险科室(如ICU、肿瘤内科、血液科等)医院感染的主要病原体。加拿大、美国以及欧洲一些国家已经多次出现艰难梭菌感染的暴发流行，引起全球的广泛关注[3]。2010年美国医疗保健流行病学学会/美国感染病学会(SHEA/IDSA)、2009年和2013年欧洲临床微生物与感染性疾病学会(ESCMID)、2013年美国胃肠病学会(ACG)均发表了CDI的诊疗指南[8-11]。

3.2艰难梭菌感染的国内外研究情况 报道显示，艰难梭菌感染在我国部分地区呈较高水平[12]。高姗等[13]在128例医院高风险科室的住院患者中，发现艰难梭菌粪便培养的阳性率为17.19%，毒素阳性率为16.41%。孔懿等[14]对江苏地区两所不同规模医院的高危人群进行艰难梭菌筛查发现，122例患者中共检出艰难梭菌38株，其中毒素阳性率为20.49%。韩晓红等[15]报道恶性肿瘤患者艰难梭菌阳性率为14.8%。国外的研究也显示，住院和长期住院患者艰难梭菌的定植率可高达30%～50%[16]。本研究结果提示，我院ICU科室存在着艰难梭菌流行的风险，尤其是长时间住院、高年龄、高淋巴细胞数的患者。本研究发现我院ICU患者艰难梭菌定植率为17.27%，与报道有所差异，这可能与地域差异、研究人群不同有关[3]。通过艰难梭菌定植的单因素分析，我们发现年龄可能与艰难梭菌定植有关，其原因可能与老年人患者基础性疾病比较多，免疫功能较差有关。另外也与ICU患者住院时间较长(长期住院，患者接触CD芽孢的机会大)，使用抗生素种类多(多种抗生素应用更易发生菌群失调)有关。研究表明，使用第三代头孢菌素、喹诺酮类、碳青霉烯类和β-内酰胺酶抑制剂会显著增加CDI发生风险[5]。本研究提示，长期使用β-内酰胺类抗生素可增加艰难梭菌感染的风险，这可能与抗生素使用易引起肠道菌群失调有关。本研究显示，β-内酰胺类抗生素的使用在艰难梭菌定植的发生过程中起了重要作用，是艰难梭菌定植发生的独立危险因素。值得注意的是，本研究还发现淋巴细胞数与艰难梭菌的定值有关，高淋巴细胞数患者艰难梭菌更容易定值，其发生机制尚待进一步探索。

3.3ICU艰难梭菌分子流行情况 由tcdA、tcdB基因编码的毒素A和毒素B是艰难梭菌产毒株中最常见的两种外毒素[3]。毒素A是一种肠毒素，可引起黏膜炎症和细胞浸润；毒素B是一种细胞毒素，其毒性比毒素A强100～1 000倍，可使细胞发生凋亡、变性、坏死、脱落。绝大多数菌株可同时产生毒素A和B，但最近越来越多的研究发现，有的菌株只产生毒素B，而不产生毒素A[2-3]。本研究中有14株艰难梭菌tcdA和tcdB基因检测阳性，占总分离株的58.3%，而二元毒素基因(ctdA/ctdB)均未检出，与亚洲各国文献报道较为一致。

3.4本研究的临床意义 艰难梭菌可引起交叉感染，其传染源包括患者、治疗好转的患者、被污染的医疗器械、物品及医护人员的手等。在当前CDI日趋增加的形势下，我们有必要做好ICU科室的主动预防监测工作，对CDI患者进行隔离，消除其播散隐患，慎用抗菌药物，密切关注长时间住院、长期使用抗生素等艰难梭菌感染高危因素的患者；加强环境清洁消毒(包括医护人员的手、台面、床等等)工作，降低艰难梭菌芽孢传播的风险，防止艰难梭菌感染的暴发、流行。

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