氯离子通道CFTR在肝脏慢性炎症中的作用

张国福，潘宁，石海红，马淑霞，王春敏，崔刚，侯霞

1.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007； 2.佳木斯市传染病院 检验科，黑龙江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大学第一附属医院 物理诊断科，黑龙江 佳木斯 154002

囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一种由cAMP激活的氯离子通道。CFTR蛋白广泛分布于人体各个具有分泌功能的组织中，如消化系统、呼吸系统和生殖系统等[1]。当该基因突变导致功能异常或减少时，细胞将无法进行正常的分泌活动，导致水盐代谢失衡，水分流失，分泌物粘稠，从而引起局部组织大分子分泌物聚集和慢性感染[2]。囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)是由CFTR突变引起一种常染色体隐形遗传病，约有65.2% CF患者会出现肝脏慢性炎症，说明CFTR表达变化与炎症发生密切相关[3-4]。肝脏在调节肠道微生态平衡中具有重要作用，肝脏炎症的发生会破坏两者之间的相互调控。在本研究中，我们利用CFTR敲除小鼠的肝组织，对炎症信号通路进行了研究，发现JNK(c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶)、AKT(丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶)等炎症相关的因子表达水平发生显著变化，所以CFTR很可能具有抗炎因子的作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 实验动物C57BL/6纯系小鼠野生型和CFTR-/-基因敲除小鼠，2月龄，由美国匹兹堡大学R.J.Frizzell教授实验室赠送。CFTR217抗体购自北卡罗林纳大学，P-JNK(sc-293136)、JNK(sc-571)、P-AKT(sc-135650)和AKT(sc-24500)抗体均为Santa Cruz产品，HRP标记的羊抗大鼠二抗(ab6741，Abcam)。Renaissance Chemiluminescence ECL发光底物试剂盒(NEN life Science产品)，X光胶片购自柯达(XOMAT BT)。

1.2方法

1.2.1组织蛋白提取 将小鼠断髓法处死后，迅速取出肝脏，剪下胆囊下侧肝组织，迅速投入RIPA裂解液[150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tri-HCl(pH 7.4)，1 mM EDTA，0.1% SDS，1% deoxycholic acid，1% Triton X-100，1 mmol/L PMSF，5 μg/mL Aprotinin，5 μg/mL leupeptin]中，用电动组织匀浆器研磨(1 000 r/min离心20 s)，13 000 r/min离心10 min，重复2次，取上清-80℃保存备用。总蛋白浓度通过BCA protein reagent kit (23225，Pirce)进行测定。

1.2.2Western blot 取50 mg总蛋白与5×上样缓冲液(10% SDS，1 mmol/L DTT，20%甘油，0.2 mol/L Tris pH 6.8，0.05% 溴酚蓝)4∶1混合，42℃水浴，10 min，经10% SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜上(22 V，12 h，4℃)。将PVDF膜用含有5%脱脂牛奶的TBST缓冲液(含有0.01% Tween20的TBS)封闭，与一抗室温孵育1 h，一抗分别采用CFTR217抗体(1∶5 000)、P-JNK(1∶200)、JNK(1∶200)、P-AKT(1∶300)和AKT(1∶300)，用含有5%胎牛血清(FBS)的TBST配制。一抗孵育结束后洗膜3次，每次5 min。二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，然后采用ECL试剂盒于暗室中显影。

1.2.3统计学处理数据 应用SPS 13.0统计软件，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CFTR-/-小鼠肝脏中CFTR表达呈阴性 将通过基因型鉴定为CFTR基因敲除的小鼠，通过Western blot在蛋白质水平进一步验证了没有CFTR表达，阳性对照为其同窝野生型(wild type，wt)小鼠(图1上)。

2.2CFTR-/-小鼠肝脏中JNK表达水平显著升高与野生型小鼠肝组织相比较，CFTR-/-小鼠肝脏中P-JNK表达水平显著升高，与其野生型同胞相比较P-JNK表达水平提高了约1.59倍(t=2.8972，P<0.05，图2)。

2.3CFTR-/-小鼠肝脏中AKT表达水平显著升高与野生型小鼠肝组织相比较，CFTR-/-小鼠肝脏中P-AKT表达水平显著升高，与其野生型同胞相比较，P-AKTK表达水平提高了约1.31倍(t=3.1179，P<0.05，图3)。

注：WT小鼠肝脏有CFTR表达，野生型CFTR有2条条带分别为完全糖基化的CFTR(C-band)和核心糖基化的CFTR(B-band)。*为非特异性条带。

图1CFTR在野生型小鼠(WT)和CFTR敲除小鼠(CFTR-/-)肝组织中的表达分析

注：A：采用Western blot方法对野生型小鼠(WT)和CFTR敲除小鼠肝组织中JNK(表达总量)和P-JNK(活化的JNK)的表达水平进行分析。B：JNK活性统计学分析；JNK的相对活性采用P-JNK/JNK进行比较，发现与WT小鼠相比较，P-JNK在CFTR-/-小鼠肝组织中提高约1.59倍(t=2.8972，aP<0.05)。

图2野生型小鼠(WT)和CFTR-/-小鼠肝组织中JNK活性分析

注：A：采用Western blot方法对野生型小鼠(WT)和CFTR敲除小鼠肝组织中AKT(表达总量)和P-AKT(活化的AKT)的表达水平进行分析。B：AKT活性统计学分析；AKT的相对活性采用P-AKT/AKT进行比较，发现与WT小鼠相比较，P-AKT在CFTR-/-小鼠肝组织中提高约1.31倍(t=3.1179，aP<0.05)。

图3野生型小鼠(WT)和CFTR-/-小鼠肝组织中AKT活性分析

3 讨 论

3.1CFTR是潜在的抗炎因子 CF患者中，感染是最主要的症状之一，炎症首先出现在呼吸道及肺部，继而发生在肝脏和胰腺，65.2%左右的CF患者会患有肝病，称为囊性纤维化相关的肝病(cystic fibrosis related liver disorder，CFLD)[4]。CFLD与CFTR突变丧失功能密切相关，因此，CFTR可能具有抗炎因子的作用。为此我们利用CFTR敲除小鼠的肝脏组织，检查了炎症相关因子JNK和AKT的活性变化。

JNK，参与哺乳类细胞中MAPK信号通路，JNK作为一种炎性因子，参与细胞的多种生理病理过程[5]。JNK磷酸化(P-JNK)水平增高是其激活的体现。我们在本研究中发现CFTR-/-小鼠肝脏中P-JNK表达水平比其野生型同胞提高约1.59倍(P<0.05，n=5)，说明CFTR-/-小鼠肝脏有慢性炎症。

AKT，是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶。AKT参与细胞多种生理病理过程，PI3K/AKT信号活化，能够促使细胞产生大量炎性因子，在机体炎症反应中发挥重要作用，AKT磷酸化(P-AKT)水平升高是ATK活化的标志[6]。为此我们检测了CFTR-/-小鼠肝组织中P-ATK的表达水平，发现与其野生型同胞相比较，P-AKT水平升高约1.31倍。结合P-JNK在CFTR-/-小鼠肝组织中升高，说明CFTR-/-小鼠肝组织中有炎症发生。

3.2CFTR缺失而导致肝脏慢性炎症可能会影响肠道微生态平衡 CF患者多会出现肠梗阻等消化系统疾病，而肝脏在维持肠道微生态中发挥着重要作用，例如胆汁能够调节肠道菌群平衡并抑制有害细菌生长；反之，肠道益生菌具有促进肠肝循环的作用。因此，肝脏出现慢性炎症会影响肠道肝脏的相互调控，从而破坏肠道的微生态平衡，也会影响肠道菌群对肠肝代谢的调控[7]。

本研究利用CFTR-/-小鼠肝组织，发现炎性细胞因子JNK和AKT活性均显著提高，说明CFTR-/-小鼠肝组织中有炎症发生，为进一步了解CFLD及CFTR突变情况下肝病的发生机制以及CFTR突变对肠道微生态的影响奠定了基础。

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