猪细小病毒H株ST细胞系高敏感性细胞的克隆

任德强，张立恒，宋新刚

（哈尔滨元亨生物药业有限公司，黑龙江 哈尔滨 150025）

利用有限稀释法和单细胞显微操作法从现有 ST细胞系中克隆出一株对猪细小病毒H株具有高敏感性的细胞克隆株 ST-5,初步研究该克隆株对猪细小病毒H株增殖的特性及稳定性。该克隆株连续传代 20代后对猪细小病毒H株感染性不变,病毒滴度最高可达107.0TCID50/mL。这一研究结果将有利于开发高效价的猪细小病毒H株灭活疫苗。

1 材料和方法

1.1 试剂培养液MEM(Gibco)；胎牛血清FBS(Gibco)；二甲基亚砜(Sigma)；Trypsin-EDTA(Gibco)。

1.2 毒株和细胞系猪细小病毒H株，实验室鉴定、保管和供应；ST传代细胞购自中国兽医药品监察所。

1.3 主要仪器设备

CO2培养箱(HF240型)，HealForce公司；细胞培养瓶、培养皿和96孔细胞培养板，美国Corning公司；倒置显微镜(TS100)，Nikon 公司。

1.4 方法

1.4.1 有限稀释法将需要克隆的细胞消化分散成单个细胞并计数。用培养液稀释至40～50个细胞/mL，96孔培养板培养，每孔加0.1mL（4～5个细胞/孔)，接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释，再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.5～1个细胞。培养6～9d后，选择单个克隆生长的孔。

1.4.2 单细胞显微操作法加入培养皿内供选择的细胞数在30～100。选择大小一致、适中、形态良好的细胞，选择位置远离其他细胞的细胞，找到合适细胞，用吸头尖对准细胞后吸入细胞。培养板每孔放入1个细胞。以加入细胞后用吸头在液面轻吹出气泡为标志。次日显微镜下观察确认并标记单克隆穴。1周左右(期间要在显微镜下多次观察确认标记筛选优异的单克隆穴)，当克隆细胞生长到1／3以上视野时，消化并转种于24孔培养板扩大培养。

1.4.3 病毒培养参照病毒制造规程进行病毒培养与收获。

1.4.4 检测方法

（1）HA测定红细胞按实验室常规方法自 HA效价低的豚鼠的心脏采血，用pH7.2 PBS配成0.6%红细胞悬液备用。测定病毒液的血凝价。

（2）TCID50测定 96孔微量培养板中每孔加入细胞悬液100μL，将待测病毒液分别作 10-1～10-7倍梯度稀释，每稀释度 6孔，每孔加入不同稀释度的病毒液 100mL，细胞对照组加 100μL细胞稀释液。置 5%CO2培养箱 37℃培养，逐日记录 CPE出现孔，观察到120h为止，按 Reed-Muench法计算病毒滴度。

1.4.5 敏感性检测 阶段性取细胞状态好的细胞株接种病毒，培养液作HA和TCID50检测，依据检测结果，筛选最优的克隆细胞株，大量冻存保存备用。

2 结果

2.1 克隆细胞筛选单细胞显微镜操作法筛选出7株、稀释法筛选出1株生长良好的单克隆细胞株。

2.2 敏感性检测

表1 PPVH株在不同ST细胞株增殖的TCID50和HA

3 讨论

3.1 实验方法的比较

本次克隆细胞用有限稀释法、单细胞显微操作法和细胞克隆技术。有限稀释法克隆技术筛选细胞最为常见。但操作繁琐，对细胞计数的要求高，获得单克隆孔穴的比率较低，需克隆次数多，耗材多，显微镜下确认工作量大。结果也不理想。与有限稀释法比，单细胞显微操作法可最大限度提高单克隆孔穴的比率。可根据实验需要预先设计克隆数。本方法所需克隆母细胞极少，缩短了前期培养时间。在确有把握肯定每次单选又不需大量克隆时，就不要选取满96孔板全部孔穴。这样也可节省时间，减轻后续工作量和节约耗材。总之，本实验采用的单细胞显微操作法克隆技术，减少了克隆次数，提高了工作效率。

3.2 敏感性

PPV凝血活性间接反映其生物活性。为了比较全面的评价PPV活性，本研究同时测定病毒含量和其血凝效价，通过检测标记为克隆细胞株ST-5对猪细小病毒H株最为敏感，对提升疫苗生产能力意义很大。

[1]司徒镇强,等.细胞培养.北京∶世界图书出版公司2000．227-231．

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