网织血小板与早发冠心病PCI术后远期预后的相关性

张 岩，王聪霞，刘晓唤，张春艳，胡艳超，马维冬，贾 珊，李永勤，韩振华

(西安交通大学第二附属医院心血管内科，陕西西安 710004)

我国的冠状动脉疾病(coronary artery disease, CAD)发病率呈逐年增高的态势，严重危害人民的健康，且发病年龄越来越年轻化。早发冠状动脉疾病(premature coronary artery disease, PCAD)是指冠心病的发病年龄为男性<45岁、女性<55岁，其患病率呈逐年增加趋势[1]。PCAD患者中约60%存在严重冠状动脉狭窄，需要经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)。应用血清标志物评价PCAD患者PCI术后的长期预后越来越受到研究者关注。既往研究表明，平均血小板体积(mean platelet volume, MPV)是PCI术后长期预后的独立预测因子[2]。而网织血小板(reticulated platelets, RPs)较MPV能提供更准确的关于血小板生成的数据[3]。

RPs存在于未成熟的骨髓细胞中，比普通血小板具有更高的细胞质mRNA和更强的活性[4]。随着血小板胞质成熟，RPs mRNA逐渐消失，体积逐渐减小。RPs相比普通血小板可更好反映骨髓血小板的生成率。RPs在急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)和中风患者中均升高[4-5]。RPs能更迅速地与胶原蛋白结合[6]，合成更多的血栓素B2，释放更多的血清素颗粒，并表达更多的糖蛋白GP Ib和GP IIb/IIIa。这些物质是血栓形成的易感因素。因此，本研究旨在探讨RPs是否可作为PCAD患者PCI术后远期主要不良心脏血管事件(major adverse cardiac event, MACE)的独立预测因子，是否与冠脉支架内再狭窄(in-stent restenosis, ISR)相关。

1 研究对象及方法

1.1研究对象纳入西安交通大学第二附属医院2010-2014年在心血管内科行PCI治疗的300例PCAD患者。研究对象入选标准：男性<45岁，女性<55岁；PCAD包括早发ACS和早发稳定性心绞痛；行PCI手术包括：直接PCI；抗血小板治疗与PCI手术间隔至少4 h；PCI术前服用阿司匹林300 mg，氯吡格雷300 mg。PCI术后应用12.5 mg替罗非斑。排除标准：冠状动脉旁路移植术；住院期间死亡者；不愿签署知情同意书的患者；参加尚未完成的临床实验；心理或生理(如疾病)无法参加本研究者；无法参加随访的患者。对照组为冠脉造影正常者250例。研究对象均签署伦理委员会知情同意书。

1.2血液样本及RPs测量在接受PCI前及抗血小板治疗前，清晨采集血液样本。均从肘前静脉取血用EDTA管收集血液标本。为了给新的血小板释放留有足够的时间和避免服用阿司匹林的急性影响，其后的抗血小板治疗与PCI之间相隔至少4 h，患者术前服用负荷剂量阿司匹林(300 mg)、氯吡格雷(300 mg)和静脉应用GPⅡb/Ⅲa受体抑制剂。

外周静脉血800 r/min离心5 min后，将富含血小板的血浆进行分离。检测管里加入5 μL荧光素PE标记的CD61单抗以区分血小板，再加入25 μL富含血小板的血浆；对照管加入5 μL荧光素PE标记的鼠抗IgG与25 μL RPs，混匀后室温避光孵育15 min，再分别加入溶血素100 μL，避光反应10 min后，检测管加入RNA试剂(TO染料-噻唑橙)0.5 mL，对照管加入PBS洗液5 mL，混匀后避光孵育染色15 min，上流式细胞仪检测。参照 Matic设计策略识别RPs。本实验室的RPs百分比(RPs%)参考值范围为(2.31±0.74)%。

1.3临床预后及随访由经验丰富的护士获取患者的详细信息，每月通过电话联系，对可能的MACE进行详细记录。电话随访至PCI术后24个月。对MACE的记录由2名随访者和1个独立的心血管病学专家完成，记录包括：复发性心肌梗死(myocardial infarction, MI)，表现为有心肌缺血症状，新的或复发性ST段在2个连续的导联抬高和/或升高的心脏生物标志物高于正常上限的2倍[7]；多支血管病变被定义为至少2个冠状动脉造影狭窄≥50%；对梗死相关动脉(infarct-related artery, IRA)涉及任何重复血运重建的支架，或在距斑块5 mm的近端或远端支架边缘定义为靶病变血运重建(target lesion revascularization, TLR)；对IRA任何重复的血运重建被定义为靶血管血运重建(target vessel revascularization, TVR)。MACE包括死亡、MI或TVR。

ISR定义为冠状动脉造影显示支架置入节段管腔直径狭窄≥50%参考管腔直径。最小管腔直径和参考血管直径的测量以舒张末期结果为准。狭窄率(%)的计算：管腔狭窄率(%)=(1-最小管腔直径/对照管腔直径)×100%。ISR判定通过复查造影确定，其标准是对支架近端、支架远端、支架内3个节段进行定量分析，支架近端和远端是指支架内距离支架边缘5 mm的范围。

2 结 果

2.1各组患者一般临床资料及ISR的比较在研究期间，300例PCAD患者接受了PCI术。10例患者因各种原因在随访期间失访。选择250例冠脉造影正常的患者作为对照组，其一般资料与病例组相匹配。病例组患者平均年龄(48.1±3.6)岁，分为急性冠状动脉综合征(ACS)和稳定型心绞痛(stable angina pectoris, SAP)组。PCAD组与对照组之间在吸烟、糖尿病、家族史、心衰及RPs(%)之间差异均有统计学意义。通过测量RPs水平不同的分组如下：RPs<8%(1组，78例)；RPs 8%～10%(2组，82例)；RPs>10%(3组，130例)。PCAD组与对照组相比，RPs(%)明显升高。RPs(%)最高组更容易出现ACS(表1)。同时，对3组患者支架内再狭窄的发生率进行两两对比，差异具有统计学意义(P=0.042)，而且3组明显高于1组(P<0.05，表2)。

表1患者基线资料及临床情况的比较

Tab.1 Comparison of baseline and clinical characteristics

项目PCAD(n=290)ACS(n=109)SAP(n=181)对照组(n=250)年龄(岁)48．12±3．6146．32±4．3449．90±2．7346．75±4．52男性[n(%)]208(71．72)86(78．89)122(67．40)175(70．00)吸烟[n(%)]126(43．44)∗52(47．71)∗73(40．33)∗54(21．60)糖尿病[n(%)]47(16．21)∗21(19．27)∗25(13．81)∗22(8．80)BMI(kg/m2)24．32±3．2124．64±3．7323．91±4．9523．54±2．52高血压[n(%)]156(53．79)64(58．72)91(50．27)76(30．40)高脂血症[n(%)]196(67．59)71(65．13)124(68．51)104(41．60)家族史[n(%)]55(18．97)∗23(21．10)∗32(17．68)∗19(7．60)HF[n(%)]17(5．86)∗11(10．09)∗6(3．31)∗5(2．00)尿素氮(mmol/L)5．32±1．715．63±1．475．00±1．234．57±1．82肌酐(μmol/L)87．23±21．6291．83±19．2792．75±20．3361．53±16．42TnI(+)[n(%)]80(27．59)∗75(68．81)∗1(0．55)0(0)冠脉病变支数[n(%)] 1195(67．24)68(62．38)127(70．17) - 259(20．34)16(14．68)43(23．75) - 335(12．07)22(20．18)9(4．97) -RPs(%)9．32±4．3113．52±2．92∗9．61±3．157．32±2．23血小板数量(×109)223±67．81 247±71．14213±69．62219±70．47平均血小板体积(fl)9．52±1．17∗10．22±1．53∗9．17±1．788．24±2．08

与对照组相比，*P<0.05。BMI：身体质量指数；TnI：肌钙蛋白；RPs：网织血小板；HF：心力衰竭。

表2不同水平RPs(%)组与ISR发生的分析

Tab.2 Analysis of groups of different RPs(%) level and occurrence of ISR

组别例数(n)支架数量(n)RPs(%)ISR[n(%)]1组78866．61±0．92 2(2．32)2组82988．93±0．79 4(4．08)3组13014611．12±0．8610(7．69)P<0．050．042

2.2心血管不良事件的随访数据随访时间的中位数为2.05年[1.96～2.09年，平均(2.01±0.6)年]，20例(6.7%)患者在随访期间经历了主要心血管不良事件；9例复发性心肌梗死，16例ISR，3例TLR，4例TVR，8例出现复杂的心功能不全。10例(3.0%)患者死亡，其中7例为心源性死亡。

2.3Cox比例风险回归分析Cox比例风险回归分析表明，吸烟(HR=2.31，95%CI：1.47～4.87，P=0.03)、心衰(HR=2.14，95%可信区间：1.32～4.95，P<0.01)、TnI(+)(HR=2.72，95%可信区间：1.57～4.37，P<0.01)、MPV>9.1 fl(HR=2.65，95%可信区间：1.34～4.69，P=0.04)和RPs>10%(HR=2.58，95%可信区间：1.12～5.35，P<0.01)与MACE发生率相关(表3)。RPs>10%对PCI术后心脏事件的发生有显著的预测作用，而且在调整了性别、年龄和动脉粥样硬化的危险因素后，RPs>10%仍为独立预测因子(校正HR=2.62，95%可信区间：1.29～6.54，P=0.02)。

表3PCAD患者行PCI术后的预测变量Cox风险比例回归分析

Tab.3 Variables as predictors of PCAD cardiac events after PCI

项目患者(n)MACE(n)HR(95%CI)PAdjustHR(95%CI)P吸烟13032．31(1．47～4．87)P=0．032．56(1．13～5．74)P=0．04糖尿病4811．87(0．96～3．12)P=0．212．11(0．91～3．75)P=0．19高血压16021．20(0．86～2．67)P=0．131．31(0．76～3．33)P=0．11高脂血症20110．98(0．69～1．57)P=0．271．27(0．68～3．79)P=0．21家族史5611．19(0．75～1．98)P=0．081．31(0．73～4．12)P=0．07HF1832．14(1．32～4．95)P<0．012．87(1．31～6．87)P=0．01TnI(+)9942．72(1．57～4．37)P<0．013．15(1．27～9．23)P=0．02MPV>9．1fl9532．65(1．34～4．69)P=0．042．89(1．09～4．23)P=0．02RPs(%) 6%～8%6410．99(0．95～2．73)P=0．071．52(0．91～3．34)P=0．06 8%～10%14621．43(0．98～3．37)P=0．061．89(0．92～3．76)P=0．06 >10%8632．58(1．12～5．35)P<0．012．62(1．29～6．54)P=0．02

TnI：肌钙蛋白；MPV：平均血小板体积；RPs：网织血小板；HF：心力衰竭。

2.4ROC曲线及Kaplan-Meier生存分析分别选取MPV、肌钙蛋白(TnI)(+)，和RPs>10%进行ROC曲线下面积的计算，RPs>10%与MPV、TnI(+)ROC曲线下面积差异无统计学意义(图1)。PCAD患者的多因素分析表明，TnI(OR=1.95，95%CI： 1.14～3.36)和RPs>10%(OR=2.58，95%CI：1.12～5.35)可作为主要终点的独立预测因子。Kaplan-Meier事件生存率曲线显示，RPs>10%比RPs<10%心血管事件发生率高(P<0.05，图2)。

图1RPs>10%与MPV及TnI(+)的ROC曲线

Fig.1 ROC curve for RPs>10%, MPV and TnI(+)

3 讨 论

RPs因与网织红细胞相似而命名，通过噻唑橙染色发现其核糖核酸产生网状模式形成新的血小板[7]。

图2RPs、HF、TnI(+)与PCAD行PCI术后的远期预后的分析

Fig.2 Association of changes of RPs, HF and TnI(+) with long-term cardiac events in PCAD after PCI

网织血小板在循环系统疾病中的比例增加，使血栓生成的风险提高，同时增加血小板的聚集[8-9]。

新生成的RPs在急性冠脉综合征和脑卒中增加，也认为其是活性更强的血小板。本研究证实了RPs在PCAD组明显增加，特别是在早期ACS中。因此，RPs可能参与血栓形成，特别是参与不稳定斑块的生成。

RPs在预测心脏不良事件中的作用未知。本研究旨在较大的患者队列中研究评估RPs的基线水平及与PCAD行PCI的患者长期预后是否存在关联。本研究采用较为简单的流式细胞仪技术测量RPs，直接经全血测定。测量值与骨髓血小板生成活性有关。

本研究采用Cox比例风险回归分析表明，RPs是心脏不良事件的独立预测因子。同时，吸烟和心力衰竭也对心脏事件有预测作用。多因素回归分析后，升高的RPs仍为2年内主要心脏不良事件的预测因子。同时，RPs的升高与ISR存在相关性，本研究显示，在RPs>10%组ISR的发生率与RPs 6%～8%组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

SANDRO等[10]研究显示，MPV升高和心血管疾病长期的临床结果如心肌梗死的关系密切。NAGEH等[2]研究显示，TnI(+)是预测PCI术后6个月主要心脏不良事件的预测因子。本研究结果显示，TnI(+)与2年的MACE结果的关系与以往的ROC分析结果相似[11]。此外，RPs>10%与TnI和MPV的曲线下面积差异无统计学意义。RPs增高尤其是RPs>10%是PCAD患者行PCI术后的主要心脏不良事件发生的独立预测因子。

同时，本研究的数据分析显示了RPs与2年随访中MACE之间的关联。Kaplan-Meier曲线的事件生存率支持了RPs>10%是可预测PACD患者PCI术后不良事件的生物标志物，并且证明了随着时间的推移，RPs>10%与长期心血管事件发生的关联更强。

本研究的局限性主要是在300例患者队列中进行RPs和临床数据的回顾性分析。可以推断，阿司匹林或氯吡格雷可能通过抑制血小板活化影响RPs的活性。本研究纳入的患者均使用了抗血小板药物，可能影响了抗血小板治疗后RPs的生成。此外，冠脉支架内再狭窄与多种因素有关，如支架的种类，支架的放置部位、支架的大小、支架放置的数量、后扩的程度，这使本研究的RPs%值与冠脉再狭窄的关系可能存在一定的局限性，尚需今后进一步探讨。

总之，RPs测定是一个反映血小板生成、血小板循环和活性的可靠标志物，且容易测试。本研究结果表明，RPs>10%与ISR相关，RPs升高尤其是RPs>10%是PCAD患者行PCI术后长期预后及MACE事件的独立预测因子。

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