利拉鲁肽对神经母细胞瘤细胞牵张损伤的神经保护作用

李建鑫，朱晓龙，苏景良，李建伟，梁海乾，孙洪涛

(中国人民武装警察部队后勤学院附属医院脑科中心，天津 300162)

颅脑创伤(TBI)具有发病急骤，高致死率和高致残率的特点。为更好研究TBI的发病机制及治疗方案，涌现出了许多体外损伤模型[1]。神经牵张损伤体外模型可以准确的模拟TBI后的细胞改变，为我们更精确的研究神经损伤的机制以及并探索可能的治疗方案。近年来，有研究[2]显示，某些肽类激素，在大量的基础研究中表现出神经保护性潜能。因此，外源性的给予这些天然肽类激素作为治疗性药物治疗神经损伤可能是潜在的治疗新策略。胰高血糖素已被证实具备神经营养和神经保护特性。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及受体在人体分布广泛且疗效多样。除治疗糖尿病外，GLP-1 受体激动剂在神经系统均能发挥良好的神经保护作用[3]。利拉鲁肽是天然GLP-1 的长效类似物，它对多种中枢神经系统疾病如神经退行性疾病具有神经保护作用[4]，但对TBI的作用尚不清楚。本实验通过可控的气体冲击制备TBI牵张损伤模型，然后给予利拉鲁肽处理，通过检测细胞活力、细胞毒性和细胞凋亡相关蛋白的表达，研究利拉鲁肽对细胞牵张损伤神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 SH-SY5Y细胞株购自上海然泰生物科技有限公司；Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗体均购自美国cell signaling公司；内参抗体β-actin和辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自碧云天生物技术研究所；I型胶原蛋白购自Sigma公司；BioFlex细胞培养板购于世联博研科技有限公司；细胞损伤控制器Ⅱ(CIC-Ⅱ)购于弗吉尼亚大学；利拉鲁肽购自吉尔生化(上海)有限公司；细胞毒性检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。

1.2 SH-SY5Y细胞系的培养 将SH-SY5Y贴壁生长的细胞株常规培养于37 ℃，5%CO2孵育箱中，培养基为DMEM/F12(1∶1)完全培养基，内含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL硫酸链霉素。细胞密度达到70%～80%时，传代或用于实验。

1.3 MTT法检测细胞活力 MTT法观察利拉鲁肽对SH-SY5Y细胞活力的影响。将培养的SH-SY5Y细胞胰酶消化后以2×104/mL密度接种于96孔板，培养48 h后，无血清诱导细胞分化12 h后，对照组给予等量的利拉鲁肽药物溶剂；利拉鲁肽组给予1 μM利拉鲁肽预处理24 h。每孔加入MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h后每孔加入三联溶解液。温箱孵育12 h，用酶标仪检测560 nm波长处各孔吸光度值(OD值)。

1.4 LDH法检测细胞毒性 取第2代培养的SH-SY5Y细胞，胰酶消化后以3×105/mL接种于Bioflex细胞培养板(I型胶原包被)中，培养48 h，待细胞汇合度达80%时，实验分为3组，对照组、细胞损伤组以及利拉鲁肽治疗组。对照组给予等量的利拉鲁肽药物溶剂；细胞损伤组将Bioflex细胞培养板与CIC-Ⅱ细胞损伤控制器相连接，控制器将气体脉冲传送至与密闭的系统紧密连接的BioFlex细胞培养板。装置上的阀门和计时器可精确控制阀门开放和气体脉冲时间。通过调节装置的压力调节器可调节控制阀门的气体脉冲压力大小。当气体触发后会引起培养板上的硅胶膜快速变形和回弹，从而造成粘附于硅胶膜上的SH-SY5Y细胞损伤，该实验设定计量阀门压力为18 PSI(磅每平方英寸)，此时气体脉冲压力1.8～2.0 PSI，制备轻度损伤细胞模型；利拉鲁肽治疗组是将轻度损伤的细胞加入1 μM利拉鲁肽处理24 h。分别取对照组，损伤组和利拉鲁肽治疗组培养上清液100 μL，严格按照LDH检测试剂盒说明进行实验操作，采用酶标仪440 nm波长处测定样品吸光度。

1.5 蛋白免疫印迹检测利拉鲁肽对SH-SY5Y细胞的神经保护作用 取第2代培养的SH-SY5Y细胞，胰酶消化后以3×105/mL接种于Bioflex细胞培养板(I型胶原包被)培养48 h，待细胞汇合度达80%时，实验分为3组，对照组、细胞损伤组以及利拉鲁肽治疗组。24 h后取对数生长期的SH-SY5Y细胞，加入RIPA 裂解液，离心收集上清，BCA法测蛋白浓度，加入上样缓冲液(Loading buffer)后变性。于10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，每组上样量为18 μg，将蛋白转印于硝酸纤维素膜上，2%脱脂奶粉封闭60 min，Bax(1∶800稀释)、Bcl-2(1∶1000稀释)和Caspase-3(1∶600稀释)于4 ℃孵育过夜。次日，HRP标记的二抗室温摇床孵育 2 h，滴加 ECL 发光液在凝胶成像系统中显影。以β-actin作为内参。

2 结果

2.1 利拉鲁肽能促进SH-SY5Y细胞增殖 为了摸索利拉鲁肽适宜的保护性作用浓度，本研究采用改良型MTT法检测并分析细胞的生长和存活情况。本实验分别给予SH-SY5Y细胞不同浓度利拉鲁肽处理(0.1 μM、1 μM和10 μM)。检测结果显示，利拉鲁肽组比对照组细胞活力显著提升，适宜保护性浓度为1 μM(F=5.931，P<0.05)(见表1)。

表1 不同浓度的利拉鲁肽对SH-SY5Y细胞存活率

注：与对照组比较，aP<0.05

2.2 利拉鲁肽能够减轻细胞损伤引起的LDH的释放水平 采用LDH试剂盒检测不同处理组中LDH漏出率，进而了解各处理组的细胞毒性。实验结果显示，与对照组相比，细胞损伤组LDH释放水平明显提升，而利拉鲁肽治疗组LDH释放水平降低(F=10.41，P<0.05)，提示利拉鲁肽减轻了机械牵张诱导的细胞损伤(见表2)。

表2 不同处理组LDH释放水平

注：与细胞损伤组比较，aP<0.05

2.3 利拉鲁肽可以减轻细胞损伤诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

2.3.1 利拉鲁肽可减少促调亡蛋白Bax的表达并増加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达 Bax是Bcl-2家族中研究最广泛的促调亡蛋白，当细胞内Bcl-2较多时，调亡趋势减弱；当细胞内Bax增多时，则Bax形成的同源二聚体占主导则易发生凋亡。Bcl-2/Bax比值对决定细胞是否进入调亡状态有重要意义。本实验采用蛋白免疫印迹法检测各处理组Bax以及Bcl-2的表达。结果显示细胞牵张损伤组Bax蛋白的表达较对照组明显增多，Bcl-2蛋白表达减少；利拉鲁肽处理组Bax蛋白表达较牵张损伤组明显降低(F=10.49，P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达明显增高(F=19.58，P<0.01)(见图1，表3)。

图1 三组的Bax、Bcl-2和β-actin蛋白的表达

组别BaxBcl⁃2Caspase⁃3(OD)对照组0．25±0．080．43±0．060．67±0．08细胞损伤组0．52±0．090．17±0．031．21±0．63利拉鲁肽组0．24±0．09a0．31±0．06b0．97±0．09a

注：利拉鲁肽组与细胞损伤组比较，aP<0.05，bP<0.01

2.3.2 利拉鲁肽可减少Caspase-3的表达 Caspase家族在细胞调亡过程中起非常重要的作用，其中Caspase-3为关键执行分子。为检测利拉鲁肽在细胞牵张损伤中的抗调亡作用，采用蛋白免疫印迹检测各组中Caspase-3的表达(见图2)。如图所示细胞牵张损伤组Caspase-3表达明显增多，而利拉鲁肽组Caspase-3的表达显著降低(F=10.05，P<0.05)。

图2 三组的Caspase-3和β-actin蛋白的表达

3 讨论

TBI是临床上常见的高致残性损伤，因TBI给家庭和社会每年都造成巨大的经济负担[5]。为更好研究TBI的发病机制及药物干预治疗，相继出现了许多TBI体外模型(如压迫损伤模型、气压损伤模型)，然而这些模型均无法准确、真实的模拟临床机械损伤作用力，无法满足实验检测的需求。细胞牵张损伤模型可以更加准确的模拟TBI的致伤作用力[6]，减少影响实验结果的混淆因素，简单可行。本实验我们利用细胞损伤装置-Ⅱ建立了SH-SY5Y细胞培养牵张损伤模型。此模型可以同时对细胞造成相对一致的损伤。本实验细胞损伤模型，更接近于人体颅脑损伤的状态，可在细胞和分子水平为我们提供损伤病理过程中的一系列重要信息，对了解TBI的病理生理机制具有重要作用。

虽然对于TBI的神经保护方面的研究已取得巨大进展，但目前临床上仍缺乏一种切实有效的药物。这可能与TBI复杂的病理生理机制有关，这也成为影响患者治疗与预后的主要难题。因此，寻找一种对中枢神经系统具有保护作用，达到治疗或延缓疾病进展的药物尤为重要。

2型糖尿病已经被认为是神经退行性性疾病的危险因素。大脑中已经发现胰岛素信号受损及胰岛素受体脱敏现象。基于两者具有共同发病机制，已有部分糖尿病治疗药物用于中枢神经系统方面的研究。GLP-1是一种促胰岛素激素肽，被用于治疗2型糖尿病[7-8]。近年来研究显示，除胰腺外，在中枢神经系统存在大量的GLP-1受体。其受体分布的广泛性决定了其生物学作用的多样性。GLP-1受体激动剂对神经系统的保护及治疗作用已被越来越多的研究所证实。Kimura等研究显示GLP-1受体激动剂可以刺激神经生长因子的PC12细胞神经突的生长、增强神经细胞的分化并改善细胞生存率[9]；GLP-1类似物的艾塞那肽在大鼠短暂大脑中动脉闭塞模型中显示出良好神经保护作用[10]。有研究成果表明，GLP-1可以保护神经元突触可塑性[11]。另外，因GLP-1 受体激动剂能通过血-脑脊液屏障直接与其受体结合，发挥神经保护作用被应用于治疗中枢神经系统疾病如阿尔茨海默病[12]、帕金森病[13]等神经退行性疾病。

利拉鲁肽是天然GLP-1的长效类似物，药理活性与GLP-1相似，主要用于治疗2型糖尿病[14]。利拉鲁肽与GLP-1有97%的同源性，既具有相似的生理作用，又不易被降解。由于利拉鲁肽的特异性受体在大脑中广泛分布，近年来，利拉鲁肽的神经保护作用被越来越多的学者重视[15]。2014年，GLP-1类似物利拉鲁肽首次被用于神经退行性疾病的相关临床试验研究。它作为一种人源性的GLP-1受体激动剂，较天然的GLP-1更稳定，可以通过血脑屏障，可促进神经元增殖，对阿尔茨海默病具有神经保护作用[16]。还有研究表明利拉鲁肽通过靶定自噬在β细胞凋亡中起重要作用[17]。因此，我们认为利拉鲁肽在细胞损伤中的保护作用与抑制细胞凋亡有密切的关系。

TBI导致的氧化应激、炎性反应可引起多种促凋亡因子的释放，激活下游凋亡相关蛋白Caspase-3，最终导致细胞凋亡[18]。目前大体上讲，凋亡的通路分为Caspases依赖型和Caspases非依赖型两种。本研究通过蛋白免疫印迹法检测各组凋亡蛋白Caspase-3的表达，结果发现细胞牵张损伤后，细胞凋亡明显增加，Caspase-3 表达也增高，而利拉鲁肽处理后，Caspase-3表达明显降低。

Caspases依赖型和Caspases非依赖型凋亡均由B细胞淋巴瘤-2家族蛋白(Bcl-2)调控。Bcl-2基因家族在细胞凋亡的发生中构成一个相互作用、相互制约的调节网络。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的平衡在凋亡发生过程中发挥着极其重要的作用[19]。Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，且基因表达量与细胞凋亡程度成正比，而Bax则作为Bcl-2 家族中最重要的促凋亡基因。因此，Bcl-2过量表达可降低细胞凋亡，Bax过量表达则可增强细胞凋亡。所以，药物可通过干预Bcl-2和Bax的表达达到抑制或者促进细胞凋亡的目的。本研究以细胞损伤控制器牵张损伤SH-SY5Y细胞来模拟颅脑创伤的体外模型，探讨利拉鲁肽是否对TBI细胞模型具有神经保护作用。结果发现，利拉鲁肽处理组，Bcl-2表达明显增高，而Bax表达下调，提示利拉鲁肽可以抑制细胞牵张损伤后细胞凋亡。

LDH是存在于机体各组织细胞内的一种糖酵解酶。当细胞凋亡或坏死后，细胞膜结构被破坏导致细胞内的LDH释放出来。因此测定LDH释放率可以反映细胞损伤的情况。本实验结果表明，细胞牵张损伤后SH-SY5Y 细胞LDH大量释放，而利拉鲁肽处理后，细胞LDH 的释放率明显降低。

综上所述，利拉鲁肽具有抑制神经细胞凋亡的作用，其可能机制还需进一步探索。本研究肯定了利拉鲁肽对TBI细胞牵张损伤模型的神经保护作用并为其向临床转化奠定了基础，并提示利拉鲁肽干预可能成为未来治疗TBI的新方法。

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