中药健脾方对糖尿病大鼠肾组织骨桥蛋白及肾脏病理的影响

2018-04-24邢艳阳李中南邢宇婷窦德梅

中国临床保健杂志 2018年2期

邢艳阳，李中南，邢宇婷，窦德梅

(1.安徽中医药大学，合肥 230038；2.安徽中医药大学第一附属医院)

糖尿病肾病(DKD)是糖尿病(DM)常见的严重慢性并发症之一，20%～40%的糖尿病患者发展成慢性肾脏病，是糖尿病患者肾衰竭的主要原因[1]。骨桥蛋白(OPN)是一种具有细胞粘附和迁移功能的分泌型磷酸化糖蛋白，可作为肾小管间质的一种重要趋化因子，通过介导该部位的巨噬细胞浸润、蛋白尿漏出、肾小球硬化等机制促进DKD的发生与发展[2]。降低糖尿病肾病骨桥蛋白的表达，抑制巨噬细胞驱化，改善早期肾脏病变程度，是延缓糖尿病肾损害的一个新途径[3]。本次实验旨在研究中药健脾方对糖尿病大鼠肾组织OPN的表达及对肾脏病理的影响，分析讨论健脾活血中药对肾脏的调节机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物取正常雄性大鼠50只，体质量(190±20)g，由安徽医科大学动物实验中心供应，合格证号：0001841。饲养房空气流通，温度维持在18～25 ℃，相对湿度保持在40%～70%，动物自由进食和饮水，适应性饲养1周。

1.1.2 药物与试剂中药健脾方由黄芪20 g、山药15 g、白术10 g、茯苓10 g、生地10 g、丹参15 g、菝葜15 g、地龙10 g、五味子5 g、黄连10 g组成，饮片由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供；盐酸吡咯列酮(杭州中美华东制药有限公司生产，批号:H20050500)；链脲佐菌素(STZ)(购自美国Sigma公司，批号：S0130)；水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司生产，批号:H3702673)；通用型二抗试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：131208K)。

1.1.3 主要仪器与设备血糖监测仪(美国强生公司，型号：稳豪型)；JD801形态学图像分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)；全自动生化仪(日本株式会社，型号:日立 7600)。

1.2 实验干预与分组将50只健康雄性大鼠予基础饲料(蛋白质16%，碳水化合物50%，脂肪8%)饲喂1周，随机抽取10只作为健康对照组，其余大鼠作实验组。对照组予基础饲料饲喂至本实验终止；实验组予高脂饲料(其中蛋白质15%，脂肪25%，碳水化合物45%，胆固醇5%，猪油10%)喂养，4周后造模，禁食8 h后，将STZ用0.1 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH值为4.4)配成2%浓度，按35 mg/kg剂量于大鼠左下腹一次性腹腔注射，120 h后取鼠尾静脉测血糖，血糖≥16.7 mmol/L视为造模成功。将造模失败的5只大鼠剔去，成模的45只大鼠随机分成模型组11只，中药组12只，吡格列酮组12只。按人与鼠的单位体质量折算系数算出各组的药用剂量，其中中药组按3 g·kg-1·d-1予健脾方灌胃，吡格列酮组按10 mg·kg-1·d-1灌胃，健康对照组和模型组按5 mL·kg-1·d-1予0.9%氯化钠溶液灌胃，各组持续饲喂8周直至本实验完成。

1.3 指标检测与方法连续灌胃，分别在第2、4周末测定各组大鼠血糖并记录，8周末测定血糖及血脂[低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)]，禁食不禁水8 h，再以3%水合氯醛按10 mg/kg给大鼠腹腔注射麻醉，迅速分离双肾，将新鲜组织放在冻存管内，并保存于液氮中，按免疫组织化学法操作标准完成。采取JD801形态分析系统分析肾组织OPN的表达图，以阳性面积及平均吸光度来表示OPN的表达强度。高倍镜(×400)下观察并记录切片中肾组织不重叠视野下的阳性细胞数。病理切片采取HE染色法，光镜下观察并比较肾组织病理学变化程度。

2 结果

实验期间模型组、吡格列酮组、中药组因血糖过高各死亡1只，两药物组因大鼠打斗各死亡1只。

2.1 各组大鼠肾组织OPN的比较高倍镜观察显示：正常组大鼠OPN在肾组织中未见明显表达；模型组OPN的表达较正常组显著升高，多呈强阳性，尤其以肾小管与肾间质细胞中较明显；与模型组对比，中药组、吡格列酮组大鼠肾组织中OPN的表达有不同程度的下降，多呈弱阳性，差异较为明显。

与健康对照组相比，模型组大鼠肾组织OPN的阳性面积、平均吸光度及阳性细胞数均明显增高(P<0.01)；与模型组相比，中药组和吡咯列酮组OPN阳性面积、平均吸光度、阳性细胞数显著降低(P<0.01或P<0.05)，差异有统计学意义。见图1，表1。

2.2 各组大鼠肾组织病理学的改变光镜观察显示：正常组大鼠肾组织形态规则，肾小球结构完整，基底膜较薄，肾小管形态完整清晰，未见炎性细胞浸润。同正常组比较，模型组大鼠肾组织形态欠规则，毛细血管袢结构不清晰，肾小球体积显著增大，可见肾小球囊腔增大、结构不规整，基底膜增厚，肾小管部分萎缩、部分扩张，间质血管有不同程度的增生，细胞外基质明显增多，肾间质内可见大量的炎性细胞浸润。同模型组比较，中药组、吡格列酮组大鼠肾组织病变有不同程度的改善，肾小球结构清晰、规则，基膜增厚减轻，可见部分肾小球体积增大，肾小管腔轻度扩张，肾小球内的细胞数目稍增多，细胞外基质增多降低，肾间质内见少许的炎性细胞浸润。见图2。

表1 各组大鼠肾组织中OPN阳性面积、平均吸光度、阳性细胞数的比较

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01，cP<0.05

2.3 各组大鼠血糖、血脂的比较与正常组相比，模型组各时段血糖、血脂(TG、TC、LDL-C)水平明显升高(P<0.01)；与模型组相比，中药组和吡格列酮组血糖及血脂水平显著降低(P<0.01)。见表2，3。

表2 各组大鼠血脂的比较

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

表3 各组大鼠不同时段血糖的比较

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

3 讨论

目前多数学者认为DKD的发病机制为糖脂代谢紊乱、遗传易患性、氧化应激、炎性反应等多种因素共同作用，导致细胞外基质增多、基膜变厚、微血管病变、肾组织纤维化等病理变化[4]。研究发现，OPN大量表达于肾脏及骨骼中，肾组织中OPN可由肾小管上皮细胞合成、分泌，高糖可诱导OPN合成增加[5]。肾组织OPN进一步介入到巨噬细胞趋化、蛋白尿渗出及肾小球硬化等多个环节，促使DKD的发生与发展。故早期阻断肾组织中OPN的表达，对DKD的治疗有重要意义[6-7]。

本次实验注意到模型组大鼠肾组织OPN的表达明显增加，多呈强阳性。中药组大鼠肾组织OPN的表达显著下降，多数不表达或呈弱阳性表达。同时，提示模型组大鼠肾组织OPN的阳性面积、平均吸光度、阳性细胞数目均显著增加；中药组和吡咯列酮组上述指标明显下降，表明中药健脾方可显著抑制OPN的表达。肾脏病理结果提示，模型组大鼠肾脏受损较为严重，予中药健脾方治疗后大鼠肾组织病变明显减轻，提示本方可减轻糖尿病大鼠肾脏病理损伤，对肾脏早期损伤具有良好的保护作用。同时实验结果显示出模型组大鼠的血糖、TC、TG等水平显著增高，予中药健脾方后大鼠的血糖、血脂水平较模型组明显降低。分析本方的作用机制，可能是通过减少炎性因子的刺激，减轻糖脂毒性对内皮细胞功能的损害，进而降低肾组织OPN的高表达，减缓肾脏的病理损害，抑制DKD的进展。

A1：健康对照组；B1：模型组；C1：中药组；D1：吡格列酮组

A2：健康对照组；B2：模型组；C2：中药组；D2：吡格列酮组

近几年，课题组从临床调查入手，发现糖尿病肾病患者中脾虚血瘀型增多。如名老中医曹恩泽主任认为，脾肾亏虚是DKD的病理基础，瘀血是DKD发病的重要病理因素[8]。糖尿病肾病虽病本在肾，但与脾胃关系密切。祖国医学认为，脾胃为乃后天之本，气血生化之源；肾是先天之本，为精血之海，生命之根[9-10]。脾肾二脏在生理上相互滋生，在病理上亦互为因果，彼此影响。同时，“久病入络”“久病致瘀”，瘀血阻络贯穿着DKD的始终，既是DKD的病理产物，又可作为其致病因素。故治疗糖尿病肾病应注意调养脾肾，活血化瘀。本实验选择健脾益气活血方符合临床实际。方中黄芪、白术、茯苓益气健脾利湿，山药健脾补肾，养胃生津；生地清热凉血，滋肾养阴；黄连清热燥湿解毒；丹参活血祛瘀，五味子滋肾生津，菝葜健脾利湿解毒，地龙活血通络、捜剔驱邪。诸药合用，达到健脾补肾，益气活血之效，全方阴阳互济，攻补兼施，扶正祛邪，使机体阴阳平，瘀浊去，肾络通。

药理研究证实，丹参、黄芪等能够降低血糖和改善胰岛素抵抗(IR)[11-12]；黄芪甲苷能够修复高糖诱导的平滑肌细胞和内皮细胞的功能障碍，故能在一定程度上保护糖尿病血管重构[13]，且黄芪通过减少肾脏局部TGF-β1、OPN的表达和巨噬细胞驱化，减轻组织损伤，保护肾脏功能，对患者整体起着矫正蛋白质及脂质代谢紊乱的作用；丹参可明显下调肾脏OPN的合成与分泌[14]；黄连中的小檗碱能增强胰岛素的敏感性，且能下调血清中游离脂肪酸，改善大鼠的高糖高脂状态，调节胰岛素分泌及改善IR[15]。山药多糖对胰岛细胞起到保护和修复作用，并能降低胰高血糖素的水平，使胰岛素的分泌增加[16]；白术能够减轻四氧嘧啶损害胰岛B细胞，或能改善胰岛B细胞功能，达到降糖效果[17]；茯苓多糖能显著升高2型糖尿病小鼠肾脏中超氧化物岐化酶及谷胱甘肽过氧化物酶的水平，减少丙二醛的含量，增强肾组织的抗氧化能力，降低脂质过氧化，改善自由基所致氧化损伤，抑制T2DM小鼠肾脏中Bax基因的表达，进而减缓肾组织细胞凋亡趋势，保护肾脏[18]；地龙能改善DKD患者的脂质代谢紊乱，保护内皮细胞，清除氧自由基，降低过氧化脂质水平[19]；生地黄、北五味子可增强抗氧化能力、加速自由基的清除[20]。菝葜提取物对于小鼠蛋清致足肿、醋酸致腹膜炎等有良好的抗炎、消肿作用，大大降低炎症部位的炎症介质，并有不同程度的免疫调节作用[21]。

综上所述，中药健脾方可能是通过多环节、多靶点提高机体免疫功能，减少炎性反应，清除氧自由基，改善血液高粘、高聚状态，抑制糖尿病肾脏病理炎症状态，调节糖脂代谢紊乱，降低肾脏骨桥蛋白的高表达，从而起到延缓糖尿病肾脏损伤，保护肾脏功能的作用。

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