同位素稀释质谱法在临床参考系统中的应用

全 灿，李红梅

(中国计量科学研究院，北京 100029)

溯源性是通过具备证明文件的不间断的校准链，将测量结果与参照物联系起来的特性，校准链中的每项校准都会引入测量不确定度[1]。中国计量科学研究院位于校准链的顶端，签署国际计量委员会互认协议(CIPM mutual recognition arrangement, CIPM MRA) ，通过国际比对，证明其测量能力，为参考物质赋值，为中间层级参考实验室测量结果提供溯源，从而为常规实验室间质量评价的质控品赋值提供溯源[2]。

参考测量程序经过充分研究，其测量值的测量不确定度适合其预期用途，尤其用于评价测量相同量的其他测量程序的正确度。同位素稀释质谱法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS)作为具有最高计量学特性的基准方法，用高丰度同位素标记物作为内标，适用于可直接或用其衍生物进行质谱分析的测量，已广泛应用于临床参考系统[3-4]。本文重点介绍了同位素稀释质谱基本原理、定量方式及其不确定度，结合检验医学溯源联合委员会 (joint committee for traceability in laboratory medicine, JCTLM)参考系统数据库，分析其在临床参考系统的应用及最新进展。

1 临床检测结果溯源性及参考系统

1.1 临床检测结果溯源性

医学诊断及其治疗都依赖于临床检测指标的准确可靠。临床上有近4 000项检测项目，涵盖不同的相对分子质量、浓度范围、形态和基体。临床检验已成为疾病诊断、治疗效果评价和健康状况监测的重要手段，临床检测结果的一致性和可比性是防病治病和提高人类健康水平的基本要求。临床检测结果关系患者、门诊医生、检验科、病理科专家、仪器厂家以及医疗管理部门等诸多相关方的利益。检测结果受“人、机、料、法、环”等因素影响。

国际计量局(bureau international des poids et mesures, BIPM)、联合国际法制计量组织(international organization of legal metrology, OIML)、国际实验室认可合作组织(international laboratory accreditation cooperation, ILAC)，以及国际标准化组织(international organization for standardization, ISO)发布《BIPM，OIML，ILAC，ISO对计量溯源性联合声明》[1]，明确提出测量结果一致性和可比性是检测结果的基本需求，只有实现可比，检测结果方可被普遍采纳。溯源性是关于测量结果的属性，使测量结果通过连续的比较链与给定的参考标准联系起来，具有一致性和可比性，给定的参考标准通常是国家或国际标准，是实现国际等效的保证。比较链中每一步都有给定的不确定度，溯源源头可以是国际单位制(international system of units, SI)或国际公认其他参考标准。

1.2 临床参考系统

患者新鲜样品检测结果的可溯源性是建立临床参考系统的主旨和最终目标。溯源性的基础是参考系统，包括参考物质、测量程序和参考实验室。参考系统应具有国际公认的计量学水平。一级参考物质(primary reference material, PRM)是指用基准方法或二种不同原理的方法定值，具有最高计量学水平，一般是纯度标准物质。目前，一级参考测量程序(基准方法)仅限于同位素稀释/质谱(ID/MS)、库仑法、重量法、滴定法和依数性(如凝固点降低)测量等[5]。国际上临床检验项目能溯源至SI单位的约有25～40个，如电解质类物质(如钾、钠、氯、镁、钙、锂离子等)、代谢物类物质(如胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、肌肝、尿酸、尿素等)和某些甾体类激素及甲状腺激素等，虽数目不大，却是临床检验常规项目的主要组成部分。其余多因测量(主要是生物大分子类物质)的复杂性(如混合物、异构体等)，使得一级参考测量过程的建立和一级参考物质的制备困难，量值溯源停留在较低水平[4,6]。临床上标记常用的主要稳定同位素列于表1，包括碳、氢、氧、氮等元素。

表1 临床上常用的稳定同位素Table 1 Frequently-used stable isotopes in clinic

2 IDMS基本概念、溯源性原理

2.1 IDMS溯源性原理

基准方法，亦称绝对方法或定义测量方法(primary/absolute/definitive method)，其定义为具有最高计量学特性的测量方法。其操作可以被完整描述和理解，不确定度可以用SI单位表述，其测量值不需要参考相同量的其他标准。具有被测量定义明确、高度特异性、不确定度分量及其影响因素清晰、最小的不确定度和最高的计量学水平等特征，常由中国计量科学院建立。根据基准方法的特征，国际物质量咨询委员会(committee for amount of substance: metrology in chemistry and biology, CCQM)确定了化学领域五种基准方法，包括同位素稀释质谱法、库仑法、重量法、滴定法以及如凝固点下降法等其他依数性测量方法[5,7-9]。同位素稀释质谱法原理是向被测样品中加入一定量的同位素，通过质谱测定同位素丰度比进行定量[8]，其主要过程为：精确称量一定质量的被测样品，配制成一定浓度Cs的样品溶液，同时精确称量一定质量的高纯度同位素配制成浓度Cl的同位素溶液，将两者混合成一定同位素丰度比的混合标准溶液，经充分混合平衡后进行质谱检测，根据测得的同位素丰度比和质量比按一定模式进行定量。

2.2 IDMS 基准方法定量方式

IDMS 基准方法定量方式主要包括单点法、括弧法以及线性法/校准曲线法，分述如下。

2.2.1单点法 精确配制1个校准混合溶液，同位素比约为1.0，计算公式如式(1)所示：

(1)

式中，Rwsample、Rwstandard分别指样品和混合标准溶液中的同位素质量比；RAsample、RAstandard分别指样品和混合标准溶液中的同位素丰度响应比。单点法要求配制的校准混合溶液以及样品中添加的同位素质量比尽可能接近1，适合经预实验后得到样品大致浓度需要精确定量的情况，具有制备样品量少的优点。

2.2.2括弧法 需要配制高标、低标2个校准混合溶液，同位素丰度比约为1.00，如(0.95～1.05) ，按比例法定量，计算公式如式(2)所示：

(2)

式中，C为待测样品中被测量的浓度，mg/kg；Rs为待测样品中同位素丰度比；Rl为低标样品中同位素丰度比；Rh为高标样品中同位素丰度比；Wh为高标样品中同位素质量比；Wl为低标样品中同位素质量比；Mlab为待测样品添加的标记质量，g；Mser为待测样品中被测量的质量，g；PS为被测量高纯物质(如纯度标准物质)的纯度。

括弧法亦称比例法，是在接近样品被测量浓度附近范围配制高标和低标混合校准溶液。同样适合经预实验后得到样品大致浓度需要精确定量的情形，可以通过多次实验，不断收紧高标、低标范围，具有定量准确的优点。按低标→样品A→样品B→高标→样品A→样品B→低标的次序进样，要求相邻两次进样的检测结果变异系数CV<1%，否则需要再增加进样次数，直至满足要求。

2.2.3线性法 亦称校准曲线法，是在样品被测量浓度范围配制系列校准混溶液(5～9个同位素质量比，如0.85～1.25)，在一定范围内校准混合溶液中同位素质量比(RW)与同位素丰度比的线性相关性，如公式(3)所示，从而回归拟合得到样品中被测量的浓度：

RW=a+bRA

(3)

线性法适合对被测样品经预实验确定大致浓度范围的情形，也适合对样品进行精确定量的情形，具有定量可靠的优点。但线性法在精确定量时要求配制的混合校准溶液较多(5～9个)，样品配制工作量大，特别是有多个被测量的情况，且要求线性相关系数r>0.999 9，以保证定量结果的可靠性，此外，线性不确定度分量也需要评定。

2.3 不确定度评定

作为基准方法，IDMS具有最高的计量学特性，即具有最低的不确定度。根据IDMS溯源原理，主要包括重量法配制和质谱法检测两个环节，相应的合成不确定度uC评定依据公式(4)：

uC=

(4)

总体分为A类不确定度和B类不确定度，其中A类不确定度是使用统计分析法评定，而B类不确定度是根据经验或其他信息，不使用统计分析法进行评定。样品溶液、同位素溶液以及混合校准溶液通常均采用重量-重量法配制，需要在控制实验室环境条件下使用高精密度天平准确称量。称重过程不确定度分量需要考虑天平浮力、线性、灵敏度、样品水分、稳定性以及称量重复性等因素影响。样品制备过程中萃取、混合平衡常常很难保证添加的同位素标记物与样品中的被测量物充分平衡，需要对样品处理过程优化，确保两者充分平衡。可通过样品添加研究评估回收率，即添加已知量的被测物至待测样品中，充分平衡后使其尽可能与被测样品接近。质谱响应主要受基质干扰、质量歧视、丰度灵敏度以及响应重复性等因素影响。在评定测量结果不确定度时，还应考虑样品的均匀性、萃取效率、分析空白、干扰影响、回收率等不确定度分量对合成不确定度的影响。

3 IDMS在临床参考测量系统上的应用

3.1 国际检验医学溯源联合委员会

国际检验医学溯源联合委员会是由国际计量局、国际临床化学与检验医学联合会(international federation of clinical chemistry and laboratory medicine, IFCC)和国际实验室认可合作组织(international laboratory Accreditation cooperation, ILAC)共同组织成立，秘书处设在国际计量局。旨在“指导和促进世界公认的医学检验等效测量，为检验医学测量标准溯源提供全球平台”。其任务就是指导和促进世界公认的医学检验等效测量，实现检验医学测量结果的可溯源性，提供全球平台。核心工作就是鉴别和遴选急需关键检验指标的可溯源性和可比性，鼓励利益攸关方参与建立参考系统。

3.2 JCTLM 数据库[10]

根据最新统计数据：截至2017年3月，JCTLM 数据库共收录了293 种参考物质，184 种参考测量程序和由17个参考实验室提供的161种参考测量服务。

3.2.1参考系统完整 具备三位一体的参考物质(包括纯度参考物质和基体参考物质)、参考测量程序和参考测量服务。目前JCTLM 数据库共有26个完整的参考系统，包括17 beta-雌二醇、孕酮、睾酮、可的松、胆固醇、血清肌酐、甘油三酯、血中尿素、血中尿酸、地高辛、γ-谷氨酸、HDLLDL 13种有机小分子；钙、镁、钾、钠、锂、氯离子6种无机电解质；以及丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、α-淀粉酶、天门冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、糖化血红蛋白7种酶及蛋白。上述13种有机小分子和6种无机电解质基于同位素稀释质谱技术参考测量程序。

3.2.2尚待完善 参考系统三要素中只有两个，还缺少一个要素。目前数据库中有39种尚待完善的参考系统，包括基于同位素稀释质谱法建立了参考测量程序的羟孕酮、羟基雌酮、VD2、VD3、甲基四氢叶酸、醛固酮、胆红素、洋地黄毒苷、雌三醇、甲状腺素、鲁米那、苯妥英、茶碱、T3T4、尿中(肌酐、葡萄糖、尿素、尿酸)等19种有机小分子和砷、镉、钴、铜、铅、汞等10种无机电解质；此外还有白蛋白、C 肽、CRP、IgGIgAIgM、转铁蛋白、transthyretin等10种大分子蛋白参考系统需要完善。

3.2.3单一要素的参考系统 目前只有其中一个要素的参考系统，共计140种，包括63种只有纯度或溶液参考物质，其中包括21种校准溶液和42种纯度参考物质；60种只有基体参考物质，包括4种血浆基质、27种血清基质和29种尿液基质。17种只有参考测量程序，包括11种血清基质、3种全血基质、2种血浆基质、1种脑脊液基质和1种尿液基质。

3.3 我国在临床参考系统方面的研究[11-13]

近年来，临床参考系统研究在国内发展迅速，目前主要是中国计量科学研究院等机构代表参加JCTLM的年会，在BIPM JCTLM中发挥积极作用，临床领域参考物质被JCTLM参考物质数据库收录。中国计量院研究人员作为评审专家或组长在JCTLM工作组中发挥着积极作用。

中国计量科学研究院基于IDMS基准方法，成功参加了系列临床领域国际比对。建立了LC-IDMS测定血清中肌酐准确定值方法，2005年6月参加了血清中肌酐国际比对CCQM-K12.1。建立了直接蛋白沉淀-低温离心的LC/MS电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI)，建立了液相色谱-同位素稀释质谱(LC-IDMS)准确测定血糖的方法，2013年参加了CCQM-K11.2血清中葡萄糖国际比对，取得了很好的比对结果，在所有实验室中成绩最好，实现了国际互认和等效一致，并对两种绝对方法进行了比较。建立了LC-IDMS测量血清中睾酮含量的高准确度方法，采用萃取和沉淀等前处理方法从血清中提取睾酮，以13C标记睾酮为内标，同时考察样品前处理过程的影响，2016年6月参加的国际临床化学和实验室医学联盟(IFCC)血清中睾酮含量测定国际比对中取得了良好成绩。2017年3月参加了国际计量比对计划(CCQM-K78)，测定水溶液中苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸四种氨基酸的含量。利用液相色谱同位素稀释质谱法，以氨基酸相对应的同位素标记物为内标，准确测定了四种氨基酸的含量，实现了亮氨酸和异亮氨酸同分异构体的完全分离。中国计量科学研究院大部分临床参考物质均采用IDMS基准方法进行定值，如胆固醇、肌酐、葡萄糖、可的松、激素等被测量定义明确的小分子化合物，可溯源至SI。

4 小结

测量结果一致性和可比性是临床检验结果互认的基本需求，只有实现可比，测量结果方可被普遍接受。溯源性是测量结果一致性和可比性的保证，临床参考系统是实现临床结果溯源性的技术途径。IDMS是一项基准方法，具有最高的计量特性，在临床参考系统方面有着广泛的应用，如用于参考测量程序的建立，血清基体标准物质的定值以及国际比对等。

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