陇南红提葡萄茎段组织培养研究

2018-04-21胡文斌张少飞

陕西林业科技 2018年1期

胡文斌，张少飞，孙娜

(陇南师范高等专科学校，甘肃成县 742500)

葡萄(Vitisvinifera)是葡萄科(Vitacvae )葡萄属(Vitis)多年生木质藤本植物[1]，品种多、营养丰富，广泛用于鲜食、酿酒或制葡萄干、罐头等食品，在全国各地广泛栽培。目前，葡萄主要采用扦插的方式进行繁殖，但长期依此繁殖容易导致品种退化，尤其是在南方地区，气候湿润，容易感染病虫，且需大量扦插材料[2-3]。植物织培养[4]是将植物体的组织、器宫、细胞，在人工条件下进行培养，使其生长、分化发育成一完整的植物的过程，可以有效保持亲本的优良性状，是目前快繁育苗，防止苗木退化的主要方法之一。近年来，关于葡萄组织培养的研究已日趋成熟，宾宇波等[5]通过比较不同消毒方法、生长调节剂的种类和浓度配比、生根培养基类型,建立了百花山葡萄组织培养快繁体系。徐美隆等[6]以酿酒葡萄“赤霞珠”为材料,研究了不同基本培养基与不同IBA浓度的组合及不同培养容器对试管苗生长的影响,优化了试管苗培养体系。

红提葡萄又名红提子、红地球等,是鲜食葡萄中最珍贵和最具有商业价值的品种之一[7]。截至目前，红提葡萄组织培养研究报道不多，且研究方法各异，未形成一套完整的能够工厂化育苗的体系，本试验选择陇南市本地最为常见的红提葡萄茎段为供试材料，从红提葡萄组织培养的外植体选择、初代培养、继代壮苗、茎叶分化、生根移栽等过程，对葡萄组培苗的诱导繁育进行研究，为陇南本地葡萄组培苗快速繁殖和大规模工厂化育苗体系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究材料红提葡萄 (采自陇南师专农林技术学院智能温室)。取当年生嫩枝，用单芽茎段作实验材料。

1.1.2 仪器试剂主要仪器有：超净工作台、灭菌锅、光照培养箱及培养架等。试剂有6-卞氨基嘌呤(6-BA)，吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制各培养阶段，根据外植体生长状况，在改良DKW培养基中附加6-BA、IAA、IBA和NAA等植物生长调节剂。基本培养基为:改良DKW+蔗糖30 g·L-1+琼脂8 g·L-1，用0.1 mol·L-1的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值至5.8～6.0，分装于250 ml三角瓶中，每瓶20～35 ml，用封口膜封好，在高压锅内灭菌，生长调节剂均在高压灭菌前加入。高压灭菌条件为：压力1.1 kg·cm-2，121℃保持20 min。

1.2.2 材料消毒和接种采集当年生葡萄嫩茎，剪掉叶子，在洗洁精下用软毛刷刷洗后，流水冲洗过夜。将材料置于超净工作台上，剪成长3～4 cm的单芽茎段，用75%乙醇消毒60 s，然后用无菌水冲洗2～3次。取出材料后用0.1%氯化汞溶液消毒，试验设3个处理，氯化汞消毒时间分别为6 min、8 min和10 min，灭菌结束后再用无菌水反复冲洗5次。在无菌条件下切去下部褐化的伤口，晾干材料表面水分后将其正插于培养基上，每瓶接种1个茎段，每处理组接种20瓶。培养室保持恒温(26±1)℃，相对湿度为50%～60%，以荧光灯为光源进行光照处理(光照强度1 500～2 000 lx，每日光照16 h)[8]，14 d后，统计接种材料的污染率和成活率，确定氯化汞消毒的最佳时间。

1.2.3 初代培养分别以MS、改良DKW为基本培养基，附加6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1，统计其萌发率，以确定基本培养基。以筛选出的培养基为基本培养基，添加蔗糖30 g·L-1+琼脂8 g·L-1，pH值5.8～6.0，附加不同浓度的6-BA和IAA，将单芽茎段接种于培养基，研究激素配比对葡萄萌芽的影响。试验设附加6-BA0.1 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1、6-BA0.1 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1、6-BA0.1 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1、6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1、6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1、6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1g共6个处理，3次重复。接种14 d后，观察芽的分化、增殖与生长情况，确定初代培养基的植物生长调节剂最佳添加量。

1.2.4 继代培养待初代培养萌发的腋芽生长至2 cm左右，在无菌环境中将其小心取下，接种于筛选出的生长状态最好的初代培养基中，对其进行壮苗增殖培养。

1.2.5 生根培养继代培养无菌芽苗生长至5 cm左右时，接种于不同生长素的1/2改良DKW培养基中进行生根培养，培养温度(25±1)℃，光照强度2 000 lx，光照14 h·d-1[9]。

1.2.6 组培苗炼苗及驯化移栽当组培苗根生长到5 cm左右长、植株长至10 cm左右时,将瓶塞去掉，置于温室内炼苗,3 d后将组培苗取出,用流水冲洗掉根部琼脂,植于温室苗床进行沙培炼苗,使组培苗逐渐适应温室环境,同时注意保湿,以防组培苗萎蔫[10]。待组培苗成活，并且长出1～2片新叶时,移入营养钵进行培养，营养土为蛭石∶土=1∶2 ,组培苗长出3～5片新叶时方可下田移栽[11]。

2 结果与分析

2.1 外植体最佳消毒时间的确定

外植体成活率以消毒8 min处理最高，为80%，且均显著高于其他处理(表1),10 min处理组虽然污染率为0%，但是由于消毒时间过长，外植体遭受破坏，导致成活率下降。表明外植体氯化汞最佳消毒时间为8 min。因此，葡萄外植体的消毒方法采用75%乙醇消毒60 s、0.1%氯化汞消毒8 min。

表1 不同氯化汞消毒时间下的外植体污染率和成活率

2.2 初代培养

2.2.1 基本培养基的确定基本培养基种类对葡萄腋芽萌发有较大影响(表2)。其中，MS培养基处理，愈伤组织较多，萌芽率较低，外植体萌芽率为55%；改良DKW培养基处理，萌芽率较高，外植体的萌芽率达到了75%，是MS培养基处理的1.37倍。表明基本培养基为改良DKW培养基时，葡萄发芽效果较好。因此，确定基本培养基种类为改良DKW培养基，以后进一步试验将在改良DKW培养基中进行。

表2 不同培养基种类的茎段萌芽状况

2.2.2 激素附加浓度的确定培养基附加不同的激素浓度，经过20 d的培养，外植体生长状态良好(图版A)，研究发现培养基附加激素浓度不同，萌芽率也不同，外植体以附加6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1萌芽率最高，达到80%(表3)。表明附加6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1对葡萄萌芽效果最好。综上分析确定，最佳初代培养基为改良DKW培养基+6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1。

表3 不同激素配比的葡萄外植体萌芽状况

2.3 继代培养

待初代培养萌发的腋芽生长至2 cm左右时，将其在无菌环境中用剪刀小心取下，接种于改良DKW培养基+6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1中，对其进行壮苗增殖培养，经过28 d培养，无菌芽苗生长良好(图版B)。

2.4 生根培养

以1/2改良DKW为基本培养基,附加IBA(0.5、1.0 mg·L-1)和NAA(0.5、1.0 mg·L-1), 分A、B、C、D等4组培养基,每组20瓶,共80瓶[7]。将无菌芽苗接种在上述培养基中,进行不定根诱导，接种28 d后统计生根情况(表4)。

分析表4可知，A处理组根系生长状态最好(图版C)，生根数量和平均根长均高于其他处理组。因此，当IBA和NAA浓度均为0.5 mg·L-1时，根系生长状态最好，今后实验可以在IBA和NAA浓度为0.5 mg·L-1左右进行调整，以确定最佳生根培养配比。

表4 不同浓度配比IBA和NAA诱导不定根的效果

2.5 组培苗炼苗及驯化移栽

分析图版D和表5可知，在沙培炼苗过程中，组培苗大量死亡，成活率极低，可能由于组培苗不适应苗床环境而引起了大量的死亡;在由苗床向营养钵移栽过程中也出现了幼苗死亡，可能是由于组培苗不适应营养钵环境，同时在转移过程中损伤了幼苗的根部，引起了组培苗的不适应。A处理组成活率最高(33.3%)，可能是因为A处理组生长状态好于其他组，平均根长高于其他组的缘故。因此，仍需要不断的实验探索，进一步改善培养条件，以提高移栽成活率。

表5 各处理组炼苗及移栽情况

图版说明：A:初代培养茎段萌发；B:继代培养试管苗增殖；C：生根培养；D：移栽成活

3 结论与讨论

本红提葡萄茎段组织培养研究结论为：(1)用75%乙醇60 s，0.1%氯化汞消毒8 min为最佳消毒时间；(2)本次实验选择改良DKW为基本培养基，最佳初代培养基配比为：改良DKW培养基+6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1，同时在用改良DKW培养基+6-BA0.2 mg·L-1+IAA 0. 2 mg·L-1对无菌芽苗进行壮苗培养，无菌芽苗生长状况良好；(3)获得最佳生根培养基的配比为1/2改良DKW+IBA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1，在此培养条件下，组培苗根系生长良好；(4)沙培炼苗过程中组培苗大量死亡，最高成活率为33.3%，可能是由于组培苗不适应苗床环境，同时组培苗由苗床向营养钵移栽过程中也出现了幼苗的死亡，这可能是因为组培苗对营养钵环境的不适应，且幼苗根部或受到了一定的损伤。

目前，在葡萄组织培养过程中，有利用叶片、茎尖、花药等为材料诱导形成愈伤组织并获得组培苗的相关报道[10]，但是目前普遍采用的仍然是利用单芽茎段进行组织培养，诱导形成无菌芽苗，进而获得组培苗。炼苗及驯化移栽是葡萄组培苗能否应用到大田生产的“瓶颈”，炼苗时要待叶片从瓶口长出，茎秆由绿色转为红色后方可进行沙培炼苗[5]。本研究选用当地最为常见的红提葡萄进行组织培养，实验过程基本顺利，由于地理、环境、气候的差异，在炼苗及驯化移栽过程中成活率并不高，以后在实验过程中可适当延长开瓶炼苗时间，同时在沙培炼苗过程中注意保湿、控温、遮阳等，不断探索炼苗及驯化移栽的条件，以提高移栽成活率。因此，今后仍需进一步研究探索，才能逐渐完善红提葡萄组培体系。

参考文献:

[1] 张剑侠，王贺飞，徐炎，等．中国野生葡萄组织培养研究[J].西北植物学报，2003，23(3):460-461．

[2] 张广波，王辉.组织培养技术对于葡萄的积极作用[J].现代园艺，2016(6):151-152.

[3] 崔鹏，高秀宇.葡萄组织培养中愈伤组织的诱导[J].湖北农业科学，2012,5(4):827-830.

[4] 修德仁.鲜食葡萄栽培与保鲜技术大全[M].北京:中国农业出版社，2004.

[5] 宾宇波，沙海峰，任建武，等.百花山葡萄组织培养和快速繁殖[J].西北林学院学报，2013，28(6)：99-102.

[6] 徐美隆，刘静，王巧珍，等.酿酒葡萄“赤霞珠”组织培养快繁技术优化[J].北方园艺,2016(22)：117-120.

[7] 李国树，范国树，邱璐，等.水晶葡萄茎尖组织培养研究[J].中国南方果树，2010，39(2)：66-67.

[8] 张福庆，于向君，薛俊.酒用葡萄组培脱毒快繁技术的研究[J].中外葡萄与葡萄酒，2001，2(1):14-16.

[9] 敬东，张丽，马洪爱，等.宁夏三个葡萄品种高效再生体系的建立[J].北方园艺，2011(22)：118-121.

[10] 沈传进，王利民.鲜食葡萄组织培养快速繁育系统的建立[J].河北农业科学，2011,15(7):16-21.

[11] 高志明，闻杰.红提葡萄组织培养的研究[J].北方园艺,2011(9)：144-145.