三氯化铝比色法检测桑叶提取物总黄酮的研究

张国权，罗崧方，黄建蓉，蔡晓燕，张延杰

（1.咀香园健康食品（中山）有限公司，广东中山 528437；2.广东药科大学食品科学学院，广东中山 528453）

桑叶是药食两用的重要资源，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎抑菌、抗肿瘤等多种生理活性和保健功能，黄酮类化合物是其中一种主要的活性成分[1-2]。紫外-可见分光光度法是植物中总黄酮含量测定的常用方法，在紫外区直接测定或经显色后在可见光区测定，显色体系以亚硝酸钠-硝酸铝和三氯化铝的研究和应用最为广泛[3-10]。不同植物提取物中黄酮类化合物成分有差异，在采用分光光度法进行含量测定时，对影响检测灵敏度和稳定性等方面的因素进行系统研究，有利于优化检测条件，提高方法的适用性。试验研究探讨三氯化铝比色法测定桑叶提取物总黄酮含量的影响因素，并对方法学进行考查，旨在更全面系统地评价检测方法的可靠性。

1 材料与方法

1.1 试剂与原料

芦丁（纯度≥95.0%），北京索莱宝科技有限公司提供；乙醇、氯化铝、乙酸、乙酸钠，均为分析纯；桑叶，购自当地药店。

1.2 仪器与设备

AEY-220型分析天平，湘仪天平仪器设备有限公司产品；SB-25-12DT型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的制备

精密称取芦丁标准品10 mg，用60%乙醇溶解，定容至100 mL，即配制成质量浓度为100 μg/mL的标准溶液。

1.3.2 样品溶液的制备

桑叶粉碎后过40目筛，以60%乙醇为溶剂，室温（25℃）超声辅助提取2次，每次30 min，料液比为1∶10（g∶mL），合并2次滤液得到样品溶液。

1.3.3 检测波长的确定

取2份1.3.1项中的标准溶液1 mL，分别置于2支10 mL的比色管中。其中，一份加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容，为未显色标准溶液；另一份加入5%三氯化铝溶液1.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容，为显色标准溶液。取2份1.3.2项中的样液1 mL分别置于2支10 mL比色管中，同上法操作，分别为未显色样品溶液和显色样品溶液。以60%乙醇作为参比溶液，扫描上述4份溶液在190～700 nm波长范围内的紫外可见吸收光谱。

1.3.4 显色条件对检测结果的影响

（1）三氯化铝添加量对吸光度的影响。分别取9份标准溶液1 mL和9份样品溶液1 mL于10 mL比色管中，加入5%氯化铝溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容。同时，制备空白组，以此作为参比溶液，测定波长于400 nm处的吸光度。

（2）缓冲液pH值对吸光度的影响。分别取5份标准品溶液1 mL和5份样品溶液1 mL于10 mL比色管中，加入5%氯化铝溶液1.5 mL，再加入pH值为2.5，3.5，4.5，5.5，6.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作为参比溶液，测定波长于400 nm处的吸光度。

（3）显色时间对吸光度的影响。取标准品溶液1 mL和样品溶液1 mL于10 mL比色管中，分别加入5%氯化铝溶液1.5 mL，再加入pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作为参比溶液，在显色10，30，60，90，120 min时，测定波长于400 nm处的吸光度。

1.3.5 方法学研究

（1） 线性关系。分别取芦丁标准溶液（质量浓度 100 μg/mL） 0，0.10，0.25，0.40，0.55，0.70，0.85，1.00，1.15，1.30，1.45，1.60 mL 于 10 mL 比色管中，依次加入5%的氯化铝溶液1.5 mL，pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液1 mL，用60%乙醇定容。以空白作为参比溶液，测定波长于400 nm处的吸光度。以质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线，得出回归方程。

（2）精密度。取1 mL标准溶液于10 mL比色管中，按照1.3.5（1） 项中方法进行显色和测定吸光度。重复测定6次，计算相对标准偏差（RSD）。

（3）重复性。分别取6份1 mL样品溶液于10 mL比色管中，按照1.3.5（1）项中方法进行显色和测定吸光度，计算RSD。

（4） 加标回收率。取3组样品溶液，分别加入一定量的标准溶液，按1.3.5（1）项中方法进行显色和测定吸光度，每个加标量重复3次，根据标准曲线查出样品溶液中总黄酮含量，计算平均加标回收率和RSD。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

标准品和样品显色前后紫外可见吸收光谱见图1。

图1 标准品和样品显色前后紫外可见吸收光谱

由图1可知，加入氯化铝显色剂后，芦丁最大吸收峰形移至波长400 nm处，而样品溶液在波长400 nm处吸光度也明显增大，并略显峰形，因此选择波长400 nm作为检测波长。值得一提的是，以60%乙醇作为参比溶液，未显色的样品溶液在波长400 nm处本底吸光度较大，未显色的对照品溶液也有一定的吸光度值，因此需要考虑溶液本底吸光度对检测结果的干扰。在后续研究中，以未加显色剂的溶液（空白）作为检测的参比溶液，测定波长400 nm处的吸光度。

2.2 三氯化铝用量的确定

5%氯化铝溶液用量对标准品和样品吸光度的影响见图2。

图2 5%氯化铝溶液用量对标准品和样品吸光度的影响

由图2可知，随着5%氯化铝溶液用量的增加，芦丁标准品吸光度较为稳定，而样品的吸光度缓慢下降，为提高检测灵敏度和稳定性，5%氯化铝显色剂溶液用量以1.5 mL为宜。

2.3 缓冲液pH值的确定

乙酸-乙酸钠缓冲溶液pH值对标准品和样品吸光度的影响见图3。

图3 乙酸-乙酸钠缓冲溶液pH值对标准品和样品吸光度的影响

由图3可知，缓冲液pH值2.5～5.5时标准品和样品的吸光度都呈缓慢增加趋势，pH值6.5时吸光度增加幅度较大。兼顾检测灵敏度和稳定性，在后续研究中，选择pH值5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

2.4 显色时间的确定

显色时间对标准品和样品吸光度的影响见图4。

图4 显色时间对标准品和样品吸光度的影响

由图4可知，在显色10～30 min内，标准品和样品的吸光度变化略为明显，二者变化趋势不一致，前者略显下降，后者略显升高；而在30～120 min内，标准品和样品的吸光度都比较稳定。因此，显色30 min进行测定。

2.5 线性关系

芦丁标准曲线见图5。

图5 芦丁标准曲线

由图5可知，在1～16 μg/mL质量浓度范围内，吸光度与芦丁质量浓度呈良好的线性关系，回归方程为 Y=0.029 8X-0.001 8（R2=0.999 5）。

2.6 精密度

按1.3.5中的方法重复测定6次，得到标准品吸光度分别为 0.287，0.286，0.286，0.286，0.288，0.287，计算相对标准偏差RSD为0.28%。可见，仪器精密度良好。

2.7 重复性

按1.3.5中的方法测定6份样品溶液吸光度分别为 0.122，0.124，0.122，0.122，0.124，0.124，计算相对标准偏差（RSD）为0.89%。可见，方法的重复性良好。

2.8 加标回收率

加标回收率结果见表1。

表1 加标回收率结果

平均回收率为100.44%（RSD=0.92%），回收率良好。

3 结论

采用三氯化铝显色法测定桑叶提取物总黄酮含量，适宜的检测条件为检测波长400 nm，显色剂5%，氯化铝溶液用量1.5 mL，乙酸-乙酸钠缓冲液pH值5.5，显色30 min进行测定。以芦丁为标准品，在1～16 μg/mL质量浓度范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数R2=0.999 5，精密度（RSD=0.28%） 和重复性（RSD=0.89%） 良好，平均加标回收率为100.44%（RSD=0.92%），回收率良好。此法适于测定桑叶提取物总黄酮含量，可为相关研究提供检测依据。

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