冷冻除脂-气相色谱-串联质谱法检测食用植物油中30 种多环芳烃

王国庆，王宗义*，程明捷，翟孟婷，马蒙蒙，黄漫青

（北京农学院食品科学与工程学院，食品质量安全北京实验室，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206）

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）是指分子中含有多个苯环的烃类化合物，主要有多苯代脂烃、联苯和稠环芳烃[1]，是环境和食品较为关注的一类污染物，其中被美国环保署优先监测的有16 种，被欧盟法规列入的有15 种（含美国环保署优先监测中的8 种）[2]。由于PAH具有致癌、致畸和致突变作用[3]，食用油是PAH通过饮食进入人体的主要途径之一[4]，PAH含量水平成为评价食用油质量安全的重要指标。目前，我国以苯并[a]芘作为食用油PAH污染的评价指标，限量为10 µg/kg[5]；欧盟则以苯并[a]芘，苯并[a]芘、苯并[a]蒽、屈及苯并[b]荧蒽4 种PAH的总和为评价指标，限量分别为2 µg/kg和10 µg/kg[6]；而食用油中PAH的国标检测方法也只涉及16 种[7]。因此，研究多种PAH的高效检测方法，对更为全面地监测和评价食用油中PAH的污染状况，保证食用油质量安全具有重要意义。

PAH的检测主要有高效液相色谱法[8-10]、气相色谱-质谱法[11-14]、液相色谱-串联质谱法[15-17]和气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GCMS/MS）法[18-19]，也有毛细管电泳法[20]的报道。其中，高效液相色谱法、气相色谱-质谱法较为常用，也是国标采用方法[21]，毛细管电泳实际应用则较少，液相色谱-串联质谱法和GC-MS/MS则由于具有更好选择性和检出能力，为PAH的检测提供新的有效手段。由于目标物含量低，克服以甘油脂为主体的样品基质干扰，是检测食用油中PAH的关键。通常需要经过溶剂提取，再使用凝胶渗透色谱法[22-24]、固相萃取[25-27]、固相微萃取[28]等方法进行净化，或者使用在线净化技术[29]等，方法相对繁琐、成本也相对较高。

本研究使用超低温冷冻除脂技术，以6 种氘标记PAH为内标，结合利用GC-MS/MS的高灵敏、高选择性，建立了样品处理简单、检测食用植物油中30 种PAH的新方法，并进行了实际应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食用油样品，11 类38 个，其中20 个购自北京地区超市，18 个由中粮营养健康研究院提供。包括大豆油6 个、花生油4 个、调和油3 个、玉米油5 个、葵花油2 个、核桃油4 个、芝麻油6 个、橄榄油3 个、菜籽油3 个、亚麻籽油1 个及油茶籽油1 个。

萘（naphthalene，NAP）、1-甲基萘（1-methylnaphthalene，1-MNAP）、2-甲基萘（2-methylnaphthalene，2-MNAP）、联苯（biphenyl，BIPH）、2,6-二甲基萘（2,6-bimethylnaphthalene，DMNAP）、苊烯（acenaphthylene，ACY）、苊（acenaphthene，ACE）、2,3,6-三甲基萘（2,3,6-trimethylnaphthalene，TMNAP）、芴（fluorene，FLU）、二苯并噻吩（dibenzothiophene，DBTP）、菲（phenanthrene，PHE）、蒽（anthracene，ANT）、1-甲基菲（1-methylphenanthrene，1-MPHE）、荧蒽（fluoranthene，FLUR）、芘（pyrene，PYR）、苯并[a]蒽（benzo[a]anthracene，BAA）、屈（chrysene，CHR）、苯并[b]荧蒽（benzo[b]fluoranthene，BBF）、苯并[k]荧蒽（benzo[k]fluoranthene，BKF）、苯并[e]芘（benzo[e]pyrene，BEP）、苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BAP）、苝（perylene，PER）、茚并[1,2,3-c,d]芘（indeno[1,2,3-c,d]pyrene，ICDP）、二苯并[a,h]蒽（dibenz[a,h]anthrancene，DBAHA）和苯并[g,h,i]苝（benzo[g,h,i]perylene，BGHIP）二氯甲烷混合标准溶液（2 000 mg/L，1 mL），二苯并[a,h]芘（dibenzo[a,h]pyrene，DBAHP）二氯甲烷标准溶液（1 000 mg/L，1 mL），NAP-D8、ACE-D10、PHE-D10、CHR-D12、PER-D12二氯甲烷混合标准溶液（2 000 mg/L，1 mL），BAP-D12甲醇标准溶液（1 000 mg/L，1 mL） 美国o2si公司；环戊烯[c,d]芘（cyclopenta[c,d]pyrene，CPP）乙腈标准溶液（10 mg/L，1 mL）、二苯并[a,l]芘（dibenzo[a,l]pyrene，DBALP）环己烷标准溶液（10 mg/L，10 mL）、5-甲基屈（5-methylchrysene，5-MCHR）乙腈标准溶液（10 mg/L，10 mL）、二苯并[a,e]芘（dibenzo[a,e]pyrene，DBAEP）乙腈标准溶液（10 mg/L，10 mL） 德国Dr. Ehrenstorfer CmbH公司；乙腈、丙酮、二氯甲烷（均为色谱纯） 美国J. T. Baker公司。

1.2 仪器与设备

7890B-7000C GC-MS/MS 美国Agilent Technologies公司；Centrifuge 5810 R高速冷冻离心机德国Eppendorf公司；RE-2000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；BF-2000氮气吹干仪 北京八方世纪科技有限公司；超低温冰柜 北京德天佑科技发展有限公司；MS 3 basic涡旋混匀器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

用二氯甲烷将各定值标准溶液分别稀释至10 mL容量瓶中，作为临时储备液于棕色贮液瓶中－20 ℃贮存，使用前于室温放置30 min。用二氯甲烷稀释临时储备液，得质量浓度分别为1、0.1 µg/mL的30 种PAH混合中间工作液和质量浓度为0.25 µg/mL的6 种稳定同位素标记的混合内标工作液，用于添加回收实验和配制标准工作液。用二氯甲烷稀释混合标准中间工作液和混合内标混合工作溶液，得质量浓度分别为1、5、10、25、50 ng/mL，内标质量浓度为10 ng/mL的标准工作液。

1.3.2 样品前处理

称取0.5 g食用油样品于50 mL离心管中，加入40 µL 0.25 µg/mL 6 种PAH内标工作液及15 mL乙腈-丙酮（4∶1，V/V）混合液，于涡旋混合器上旋涡提取（2 000 r/min）5 min，10 000 r/min离心5 min使溶液充分分层后，于超低温冰箱冷冻10 min，将上层清液倒入到鸡心瓶中，40 ℃水浴中旋转蒸发至大约1 mL，氮吹至近干，加入二氯甲烷1 mL，涡旋5 s，转移至进样瓶中，上机检测。试剂空白样，除不加样品外，其他操作相同。

1.3.3 仪器分析条件

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；程序升温：初始温度为50 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升至250 ℃，保持1 min；以8 ℃/min升至310 ℃，保持8 min。载气（He，纯度＞99.999%）流速：1.0 mL/min；进样口温度：320 ℃；不分流进样；进样体积：1 µL。

1.3.3.2 质谱条件

离子源温度为280 ℃，电离模式为电子电离源，溶剂延迟时间为6 min，传输线温度为310 ℃，灯丝电流为35 µA，电子能量为70 eV，多反应监测模式（multiple reaction monitoring，MRM）检测参数见表1。

表1 30 种PAH及6 种内标物的MRM参数Table 1 MRM parameters for 30 PAHs and 6 internal standards

2 结果与分析

2.1 样品前处理

食用油中PAH的提取多选乙腈为溶剂，Zhou Ruize等[30]使用近80 倍样品体积正己烷饱和的乙腈溶液提取食用油中的PAH，去除了脂肪，获得良好效果；Thongsuk等[31]的研究表明，使用乙腈-丙酮溶液作提取剂，更有利于提高重质PAH的提取率。本实验选择使用乙腈-丙酮（4∶1，V/V）溶液为提取剂，考察样品质量为0.5 g时，不同体积、不同涡旋时间PAH的提取效果。结果表明，在本研究确定的实验条件下，即提取液用量为15 mL，涡旋时间为5 min，90%的PAH单次提取的回收率大于80%，满足定量要求。

为了提高冷冻除脂的效率，本研究使用－80 ℃的超低温冰柜进行冷冻，发现当冷冻时间小于5 min时，有机提取溶剂与油脂均为液态，冷冻时间大于15 min时，有机提取溶剂与油脂均为固态，冷冻时间为10 min左右时，下层油脂保持固态，上层提取液仍为液态，因此确定冷冻时间为10 min。冷冻后，上层提取液可方便地倾入鸡心瓶中，实现与油脂充分分离。

旋转蒸发剩余体积也是影响PAH检测的重要因素，当旋蒸至近干时，NAP、2-MNAP、1-MNAP、BIPH、DMNAP损失较为严重，ACY、ACE、TMNAP也有一定的损失，因此，当旋蒸至1 mL左右时改用氮气吹干，可有效避免上述损失。

2.2 GC-MS/MS检测结果

对于色谱分离与质谱检测条件的优化，在文献[18-19,30]的基础上，重点根据样品基质的干扰情况对PAH离子对参数进行了优化，选择干扰较小的离子对作为定量离子对，典型总离子流分离色谱图如图1所示，其中保留时间在23～26 min时共流出物干扰明显，但各相应目标物离子对色谱峰于其保留时间处无明显干扰，如图1中的插图所示。结果表明，本研究确定的提取和冷冻除脂方法，结合GC-MS/MS的高选择性和检出能力，能够大为简化食用油PAH检测的样品前处理，具有操作简单、用时少且成本低的特点。

图1 30 种PAH的总离子流与MRM色谱图Fig. 1 TIC and MRM chromatograms of 30 PAHs

2.3 检出限、定量限、线性考察结果

检出限、定量限是通过对样品和加标样品中目标物定量离子对的信噪比不小于3和10，且定性离子对色谱峰可识别的前提下，估测而得，结果见表2，在取样量为0.5 g的前提下，仍然获得足够的检出能力，检出限为0.1～1.83 µg/kg，定量限为0.35～6.11 µg/kg，优于国标方法[21]。考虑经样品处理，最终样品溶液中PAH的可能范围，对PAH质量浓度为1～50 µg/L范围进行了验证，所有目标物均呈现良好的线性关系，R2大于0.998，见表2。

表2 30 种PAH的线性、检出限与定量限Table 2 Linear ranges, LODs and LOQs for 30 PAHs

2.4 回收实验和精密度实验结果

通过对5、20 µg/kg和50 µg/kg添加量实验，结果见表3，目标物测定相对标准偏差为1.18%～12.47%，回收率为67.77%～119.28%。

表3 30 种PAH的回收率及精密度（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations for 30 PAHs (n= 6)

续表3

2.5 实际样品的应用

表4 食用油样品中PAH含量的测定Table 4 Levels of PAHs in edible oil samples

应用本方法检测了市售11 类38 个食用油样品，每个样品重复测定2 次，检出率和含量范围见表4，其中，芝麻油中未检出ICDP、DBAHA和BGHIP，玉米油中未检出DBAHA和DBALP，橄榄油和核桃油中未检出PER、DBAHA和DBALP，亚麻籽油和油茶籽油中未检出DBAHA和DBALP，所有样品中均未检出DBAEP和DBAHP；BAP含量在1.94～7.40 µg/kg之间，低于我国食用油国家标准的限量规定[5]；轻质PAH（含2～4芳香环，包括NAP、1-MNAP、2-MNAP、DMNAP、TMNAP、BIPH、ACY、ACE、FLU、DBTP、PHE、1-MPHE、ANT、FLUR、PYR、CPP、BAA、CHR和5-MCHR）含量在85.14～850.72 µg/kg之间，重质PAH（芳香环数不小于5，包括BBF、BKF、BEP、BAP、PER、ICDP、DBAHA、BGHIP、DBALP、DBAEP和DBAHP）含量在7.42～54.44 µg/kg之间，PAH总量在92.56～905.16 µg/kg之间。

3 结 论

本研究建立了冷冻除脂-GC-MS/MS检测食用植物油中30 种PAH的新方法。方法具有样品处理简单，选择性好，灵敏度高，定性、定量可靠等特点，可满足对食用油中30 种PAH的监测的需要。通过市售食用植物油样的检测表明，依据我国相关限量标准，市售食用植物油PAH污染处于较安全水平。

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