基于酪蛋白自组装法制备α-生育酚/酪蛋白纳米粒及其α-生育酚稳定性分析

何 盼，徐伟丽,*，米雅清，何胜华，李 洋，佟云娇

α-生育酚（α-tocopherol，α-TOC）广泛分布在动植物油中，其化学结构式为C29H50O2，分子结构式如图1所示[1-2]。α-TOC为淡黄色油状液体，不溶于水，在无氧条件下即使加热到200 ℃也不易分解，但对氧十分敏感，其在碱性条件下特别容易氧化[3-4]。一般认为生育酚的主要功能是抗氧化作用，其在人体内的抗氧化作用主要表现为延缓衰老、抗不育、提高免疫力等，在医学上广泛用于治疗心血管疾病、抗肿瘤和预防衰老，并取得了良好的效果[5-7]。但由于α-TOC不溶于水，很难添加于食品中，又因为其结构特性，易被氧化破坏，使得生物利用率较低甚至失去生物活性，使α-TOC在储藏和应用方面存在一定的局限性。采用纳米体系对其进行保护是目前解决这一问题最有效的手段之一。

酪蛋白（casein，CN）广泛存在于牛奶中，在牛奶中形成的高度水合胶粒称为CN胶束[8-10]，CN表面的两亲基团使CN包埋疏水性分子的同时可形成纳米粒子悬液[11-18]。由于CN能自组装成纳米粒从而成为包埋营养物质的良好载体[19-23]；其自身也具有较高的营养价值，水解后可以产生生物活性肽和多种氨基酸，在人体内具有其他生理作用[10]。因此选择CN作为载体，通过自组装形成α-TOC/CN纳米颗粒并测试其稳定性，从而改善α-TOC的光敏性、热敏性、易氧化等加工适应性，保持其原有的化学特性和生物活性，并实现可控释放，为解决α-TOC的应用局限性提供参考，以期扩大α-TOC在食品加工中的应用和深化CN资源的开发利用。

图1 α-TOC结构式Fig. 1 Structure of α-TOC

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-TOC、酪蛋白酸钠 美国Sigma公司；柠檬酸三钾 天津市致远化学试剂有限公司；磷酸氢二钾天津市天力化学试剂有限公司；无水氯化钙 天津市光复精细化工研究所；盐酸 哈尔滨伊世达有限公司；氢氧化钠 天津市永大化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA223S型电子分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；pHS-3C型实验室pH计 上海伟业仪器厂；101-2A型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；79-3型恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器厂；XMTD-3302型电热恒温水浴锅、RHYG-4S型电动搅拌器 常州市人和仪器厂；NanoZS90型激光粒度仪 英国Malvern仪器有限公司；Quanta x50 FEG扫描电镜 FEI香港有限公司；Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪、SuperModulyo型真空冷冻干燥机 美国Thermo Fisher公司；H-7650透射电子显微镜、F-2700荧光分光光度计 日本Hitachi公司；UV-2100型紫外-可见光分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；BCD-221型4 ℃冰箱 河南新飞电器集团有限公司；BCD-208K/A型－20 ℃冰箱 青岛海尔有限公司；Winne801光相关纳米粒度仪 济南微纳颗粒仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-TOC/CN纳米粒的制备

α-TOC溶液的制备：250 mg α-TOC溶于10 mL无水乙醇中，充分溶解后4 ℃避光保存。

根据Semoet等[24]的方法制备重组CN胶束：在200 mL 5%酪蛋白酸钠溶液（溶于蒸馏水中）中加入3 mg α-TOC（对照只加同体积乙醇）、4 mL 1 mol/L柠檬酸三钾、24 mL 0.2 mol/L K2HPO4溶液和20 mL 0.2 mol/L CaCl2溶液。而后每隔15 min在37 ℃恒温浴边搅拌边加入2.5 mL 0.2 mol/L K2HPO4溶液和5 mL 0.2 mol/L CaCl2溶液，共计8 次。使用0.1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液调节pH值为6.7，用蒸馏水定容到400 mL。然后适度搅拌1 h（350 r/min），每个实验都重复进行。

样品和对照分散体系（10 mL）被放置在拧紧盖的20 mL小瓶中，于74 ℃恒温水浴热处理20 s以便更好地形成自组装粒子。

1.3.2 单因素试验

以荧光强度为评价指标，固定其他条件按照上述制备方法分别对组装温度（25、28、32、37、44、48 ℃）、α-TOC与CN质量比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500）、pH值（6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）进行单因素试验。使用荧光光度计测定相对荧光强度，其中激发波长为301 nm，发射波长为409 nm（稀释倍数为2）。以确定自组装法的最佳组装温度、质量比和pH值。

1.3.3 α-TOC/CN纳米粒的表征

1.3.3.1 粒径测定

将α-TOC/CN纳米粒用激光粒度仪分析其粒径，对照组用200 mL 5%的酪蛋白酸钠溶液定容至400 mL。粒径测定参照Thiebaud等[25]的方法：用去离子水将样品稀释至原来体积的1/10，室温静置1 h，以破坏CN胶束。接着再稀释至1/1 000，稀释液于20 ℃适度搅拌。取100 mL处理好的样品用激光粒度仪进行粒径分析。

1.3.3.2 形貌观察

将干燥后的纳米颗粒喷金，在Quanta x50 FEG扫描电镜下（加速电压5 kV）观察外部形态。取一滴纳米溶液加到铜网上，采用漂浮法进行负染，负染剂为3%铀染色，负染时间为35 s，置于透射电镜下观察形貌（加速电压80 kV）。

1.3.3.3 傅里叶变换红外光谱分析

将纳米颗粒压片后进行衰减全反射傅里叶变换红外光谱分析，波数范围为400～4 000 cm－1，分辨率为4 cm－1。

1.3.4 α-TOC含量的测定

1.3.4.1 α-TOC包封率和载药量计算

CN重组装后的体系中除有包埋的α-TOC，还有游离的α-TOC。测定α-TOC总质量和游离α-TOC质量，按公式（1）和（2）计算纳米粒的包封率和载药量：

1.3.4.2 α-TOC标准曲线的绘制

精确称取200 mg 93% α-TOC醇溶液溶于50 mL正己烷中，待完全溶解后用正己烷定容至100 mL，配制成2 mg/mL的α-TOC溶液，作为标准品备用液。取1 mL样品溶液置于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，作为工作液。精确吸取工作液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀。用正己烷作空白，用紫外分光光度计于297 nm波长处分别测定标准溶液的吸光度，以α-TOC质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出线性回归方程为y=0.006 4x－0.003 5，R2=0.999 6。

1.3.4.3 样品游离α-TOC质量的测定

游离的α-TOC用膜分离方法获得：4 000×g离心30 min，游离的α-TOC会渗透到滤液接收器，封装在CN纳米颗粒的α-TOC会留在过滤装置。滤液中得到的游离α-TOC先用氮气流除去乙醇，然后用正己烷提取至适当的浓度，最后彻底涡旋，用紫外分光光度计测定在297 nm波长处的吸光度。代入回归方程，算出游离α-TOC的质量。

1.3.5 α-TOC/CN纳米粒稳定性的测定

将α-TOC/CN纳米粒于培养皿中－20 ℃冷冻过夜，放入冷冻干燥机真空干燥48 h，调蒸馏水pH值至与样品pH值相同，用其溶解冻干样品并用相关纳米粒度仪测定粒径大小。

1.3.5.1 贮存稳定性

实验设置4 ℃以及室温2 个条件，将样品在4 ℃（或室温）避光贮存48 h后与无水乙醇等体积混合磁力搅拌，加入200 μL 1 mol/L NaOH溶液，用正己烷对α-TOC进行萃取，直到水相呈无色透明。正己烷相于297 nm波长处测定吸光度，根据公式（3）计算保留率：

1.3.5.2 组装温度对α-TOC稳定性的影响

将实验组和对照组样品分别置于60 ℃下避光保存48 h，计算保留率。

1.3.5.3 氧化剂对α-TOC稳定性的影响

将实验组与对照组样品各取1 mL分别加入1 mL 20 μg/mL FeCl3溶液，室温避光保存48 h，计算保留率。

1.4 数据分析

采用SPSS 13.0软件进行显著性分析，采用单因素Duncan法进行多重比较，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 组装温度对α-TOC/CN纳米粒相对荧光强度的影响

CN能够发出荧光，当α-TOC与CN形成α-TOC/CN纳米粒时，CN的疏水基团发生荧光淬灭[26]，自组装包埋形成的α-TOC/CN纳米粒相对荧光强度比未包埋的α-TOC相对荧光强度低。因此，可以通过测定相对荧光强度的大小来反映复合纳米粒的结合强度。

组装温度的改变会影响CN结构上的变化，从而影响α-TOC/CN纳米粒的结合，因此确定最适操作温度会提高纳米粒的结合强度。取3 mg α-TOC于400 mL CN溶液中（pH 6.7），对不同组装温度下制备的α-TOC/CN纳米粒相对荧光强度的测定结果如图2所示，结果表明：在25～37 ℃范围内，相对荧光强度波动不大；当37～48 ℃时，相对荧光强度逐渐增大，这可能是由于温度升高导致蛋白质部分变性使得大部分α-TOC与CN不能紧密的结合。由图2可知，组装温度为37 ℃左右时，纳米粒的相对荧光强度最小（P＜0.05），结合程度最高。

图2 组装温度对α-TOC/CN纳米粒的影响Fig. 2 Effect of temperature on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanocomposites

2.1.2 α-TOC与CN质量比对α-TOC/CN纳米粒相对荧光强度的影响

据于钰等[10]实验研究，纳米复合物的包埋程度受原料量的影响，因此本实验通过测定α-TOC与CN质量比以确定CN对α-TOC的包埋程度。在pH 6.7、组装温度37 ℃条件下，对不同质量比条件下制备的纳米粒相对荧光强度测定结果如图3所示，结果表明：质量比在1∶5～1∶100时，相对荧光强度变化不大，可能是由于与CN结合的α-TOC有限，导致α-TOC大部分都还处于未结合状态，从而导致这一范围内相对荧光强度高且变化不大，当质量比为1∶100～1∶300时，相对荧光强度急剧下降，纳米粒结合的程度较高，其原因可能是在质量比为1∶100时虽然α-TOC的含量较高但其大部分以微晶形式存在，使得进入CN被包埋的较少，而在质量比1∶300时α-TOC是以分子形式存在，更易于结合到CN的疏水微区中，使得两者的结合程度较高[10]，而质量比为1∶300～1∶500时，相对荧光强度又逐渐增加，这可能是由于随着质量比的减小，溶液中α-TOC虽都能达到最大程度的结合，但未包埋的CN增多，所以其相对荧光强度又逐渐升高。因此当α-TOC与CN质量比为1∶300时，α-TOC与CN结合程度较高（P＜0.05）。

图3 α-TOC与CN质量比对α-TOC/CN纳米粒的影响Fig. 3 Effect of α-TOC to sodium caseinate ratio on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanoparticles

2.1.3 pH值对α-TOC/CN纳米粒相对荧光强度的影响

pH值的变化会改变聚合物的带电状态，从而影响聚合物分子之间的静电作用、盐键作用、氢健作用和疏水作用以及聚合物分子结合程度[11]。在组装温度37 ℃、α-TOC与CN质量比为1∶300的条件下，对不同pH值下制备的α-TOC/CN纳米粒荧光强度的测定结果如图4所示。结果表明：随着pH值的升高，纳米粒相对荧光强度呈现先减小后增大的趋势，在pH值为6.8时，纳米粒相对荧光强度最小（P＜0.05），结合程度最高，这可能是由于在pH 6.8时使得α-TOC与CN疏水基团氢键结合能力最强，使得其相对荧光强度最小，同时Sáiz-Abajo等[27]也表示在利用CN自组装时在pH 6.7附近效果最佳。因此选用pH 6.8为制备α-TOC/CN纳米粒最佳pH值。

图4 pH值对α-TOC/CN纳米粒的影响Fig. 4 Effect of pH value on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanoparticles

2.2 α-TOC/CN纳米粒的表征结果

2.2.1 α-TOC/CN纳米粒粒径

图5 α-TOC/CN纳米粒粒径的测定Fig. 5 Particle size distribution of α-TOC/CN nanoparticles

由图5可知，α-TOC/CN纳米粒平均粒径为（135.6±13.7）nm，粒径范围为80.3～306.5 nm，且多分散系数为0.157，表明经自组装后纳米颗粒分散性良好，粒径分布较均匀，体系稳定，适合用于后期研究[28]。

2.2.2 形貌观察

最佳条件下所制备的α-TOC/CN纳米粒扫描电镜和透射电镜结果如图6所示，复合纳米颗粒形状类似圆状，分散性良好，粒径分布比较均匀，粒径与之前用激光粒度仪所测的结果一致。

图6 α-TOC/CN纳米粒扫描电镜图（A）与透射电镜图（B）Fig. 6 SEM (A) and TEM (B) images of α-TOC/CN nanoparticles

2.2.3 傅里叶变换红外光谱结果

α-TOC/CN纳米粒与未包埋α-TOC的CN纳米粒红外光谱测试如图7所示，3 000 cm－1附近的宽峰为CN中N—H键伸缩振动所致，α-TOC/CN纳米粒在此处的吸收峰为3 300.25 cm－1，而对照CN纳米粒的吸收峰为3 307.20 cm－1，通过对比可知，分子间、分子内氢键作用使得该峰的伸缩振动频率向低波数方向移动，表明α-TOC与CN的氢键作用增强了[29]。而α-TOC/CN纳米粒中1 659.14 cm－1及CN纳米粒中1 658.96 cm－1峰均能说明两者具有α-螺旋结构，有利于蛋白质在油水界面上快速吸附和定向。在920.20 cm－1处，α-TOC/CN纳米粒出现了一小峰，可能是由于α-TOC与CN结合后引起CN中N—H面外弯曲振动引起的，再次证明了α-TOC与CN之间存在相互作用力。通过上述分析证明了α-TOC被成功包埋进入CN内部。

图7 α-TOC/CN纳米粒与CN纳米粒的红外光谱图Fig. 7 FTIR spectra of CN and α-TOC/CN nanoparticles

2.3 α-TOC包封率和载药量

图8 α-TOC包封率和载药量Fig. 8 Encapsulation efficiency and drug loading capacity of α-TOC

从图8可以看出，随着α-TOC加入量的增加，α-TOC/CN纳米粒包封率先降低后增大，载药量逐渐增大，在α-TOC与CN质量比为1∶10时包封率和载药量都呈上升趋势，该测量结果与于钰[10]的研究结果相符合。质量比为1∶300～1∶100时，由于α-TOC含量增加，在溶液中以微晶形式存在的α-TOC也增多，使得α-TOC不易与CN结合，所以其包封率会逐渐下降。在α-TOC与CN质量比为1∶300时，包封率和载药量分别为（97.97±7.38）%和（0.33±0.03）%。

2.4 α-TOC/CN纳米粒的稳定性分析

2.4.1 冻干对纳米粒粒径的影响

将α-TOC/CN纳米粒溶液进行冻干处理后，测定其粒径结果如图9所示，经冻干后的纳米粒粒径并未发生大幅改变（P＞0.05），因此可知α-TOC/CN纳米粒具有良好的冻干稳定性。

图9 冻干前后α-TOC/CN纳米粒粒径变化Fig. 9 Change in particle size of α-TOC/CN nanoparticles after freeze drying

2.4.2 4 ℃贮存稳定性

图10 4 ℃避光30 d贮存α-TOC和α-TOC/CN的保留率Fig. 10 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN during 30 d storage at 4 ℃

由图10可知，随着贮存时间的延长，α-TOC保留率逐渐降低，但与纯品α-TOC相比，α-TOC/CN纳米粒保留率更高（P＜0.05），由此可知，在4 ℃条件下，经过CN的包埋提高了α-TOC的贮存稳定性。

2.4.3 室温贮存稳定性

图11 室温避光贮存α-TOC和α-TOC/CN纳米粒的保留率Fig. 11 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN during 30 d storage at room temperature

由图11可知，随着贮存时间的延长，虽然α-TOC/CN纳米粒和α-TOC的保留率都逐渐降低，但与纯品α-TOC相比，α-TOC/CN纳米粒保留率更高且下降较缓慢（P＜0.05），因此可知室温下经过包埋的α-TOC要比纯品的α-TOC贮存稳定性好。

2.4.4 氧化剂对α-TOC稳定性的影响

综合比较α-TOC/CN纳米粒和α-TOC纯品分别经4 ℃保存、室温贮存、60 ℃加热处理和氧化剂FeCl3处理避光保存48 h后所测得的保留率，结果如图12所示。在各种处理中经过包埋的α-TOC要比未包埋的α-TOC保留率有所提高，其中4 ℃和FeCl3组α-TOC纳米粒的保留率显著提高。4 ℃处理的纳米粒与对照组相比没有显著差异（P＞0.05），故4 ℃贮存效果最好。

图12 不同处理条件下α-TOC和α-TOC/CN保留率Fig. 12 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN with different treatments

3 结 论

采用自组装法包埋疏水性α-TOC，在制备α-TOC/CN纳米粒最佳条件的同时考察了不同条件下α-TOC/CN纳米粒稳定性的变化。结果表明，当制备条件为组装温度37 ℃、pH 6.8、α-TOC与CN质量比1∶300时，α-TOC与CN结合较紧密，为制备纳米复合物的最佳条件。所得纳米粒平均粒径为（135.6±13.7）nm，包封率为（97.97±7.38）%，载药量为（0.33±0.03）%。纳米粒大小均一且分散性较好。此外，经过冻干以及在不同温度（4 ℃、室温、60 ℃）和氧化剂FeCl3的处理后，由稳定性测试结果可知该纳米粒具有良好的稳定性，其中在4 ℃下贮存该纳米粒稳定性最好。用CN包埋α-TOC不仅提高了α-TOC的稳定性，同时在操作方法上较为简单和经济，除酸碱外未添加过多化学试剂，安全性高，符合食品加工标准，为CN进一步资源化利用提供了可能。

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