HBV相关原发性肝癌患者血清B7-H3与IL-21的表达及其临床意义*

李成德 全 毅 蔡健梅 吴小文 申学基 阮德斌 张 琳 李海珠

(广东省肇庆市第一人民医院检验科，肇庆 526020)

共激刺分子B7-H3(B7 homologue 3，B7-H3)是B7家族的新成员，是由316个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其mRNA 广泛表达于人体组织中，并在多种肿瘤组织包括原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中高表达，参与HCC的侵袭和转移[1]。白细胞介素-21(Interleukin-21，IL-21)作为新的免疫系统调节因子，是2000年发现的IL-2细胞因子家族成员，其在免疫调节[2]、抗肿瘤[3]中的作用越来越受到研究者的重视。 原发性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC) (简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一，目前已知的与肝癌相关的肝炎病毒不少，乙型和丙型肝炎病毒是至今已初步明确的多见病源，其导致肝细胞转化的机制仍然未明[4]。 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是全球性人类健康问题，在慢性乙型肝炎患者中，约15%～25%死于重型肝炎、肝硬化或肝癌。研究表明，在中国，肝癌患者多数由HBV持续感染所致。由于可溶性B7-H3(Soluble B7-H3，sB7-H3)、IL-21与HBV相关原发性肝癌的相关研究却鲜见，本组对HBV相关原发性肝癌血清B7-H3和IL-21表达及二者间的关系进行了研究，并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象 2014年1月～2015年6月期间在本院住院且资料完整的HBV相关肝病患者，包括肝癌组50例原发性肝癌，男45例，女5例，年龄(55.5±9.9)岁；良性组71例乙肝患者[包括急性肝炎12例，男8例，女4例，年龄(33.3±10.4)岁；慢性中至重度肝炎21例，男15例，女6例，年龄(44.8±16.6)岁；代偿型肝硬化20例，男14例，女6例，年龄(47.6±14.5)岁；失代偿型肝硬化18例，男13例，女5例，年龄(52.4±10.7)岁]。经生化和免疫检测正常者20例为正常组，男15例，女5例，年龄(33.2±12.6)岁。 病例入选标准：原发性肝癌诊断符合《中国肝癌诊治指南》(2009版)；慢性乙型肝炎或肝硬化等诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2010年)[5]。本研究经医院伦理学委员会批准，患者知情同意。患者标本均在治疗前抽取；要求使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3 000 r/min离心 10 min，迅速小心地分离血清，置-70℃冰箱备检。

1.1.2材料与试剂 酶标仪雷杜RT-6000酶标仪 (上海斯立普)，恒温箱比朗HH-420 (上海比朗)，全自动洗板机(郑州基波斯)。 实时荧光定量扩增仪ABI7500 (美国ABI)，干式恒温器，K10CD(杭州蓝焰)。人可溶性B7同源体3(sB7-H3)ELISA试剂、IL-21 ELISA试剂品牌均为Rapidbio，购自上海研辉生物科技有限公司；HBV DNA定量试剂(湖南圣湘)。

1.2方法

1.2.1sB7-H3定量检测 样本孔先加待测样本10 μl，再加样本稀释液40 μl。除空白孔外，每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体 100 μl，封板膜封住反应孔，37℃温育60 min。经全自动洗板机洗板之后，加底物 A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；最后加入终止液 50 μl，15 min 内测定，比色波长为450 nm。所得曲线方程：y=23.266x-0.798 7，相关系数为0.991 4。试剂灵敏度为1.0 ng/ml。

1.2.2IL-21定量检测 操作流程同sB7-H3，所得曲线方程：y=336.16x+0.064 6，相关系数为0.993 1。试剂灵敏度为 1.0 pg/ml。

1.2.3HBV DNA定量采用实荧光PCR法检测，试剂灵敏度为 5.0×102拷贝/ml。

2 结果

2.1一般资料 基础资料详见表1。为便于分析，病例按HBV DNA定性、定量结果分组，分别设定分组标准：HBV DNA定性分组：HBV DNA定量<1.00×103拷贝/ml为阴性组， ≥ 1.00×103拷贝/ml为阳性组； HBV DNA定量分组：HBV DNA<1.00×103拷贝/ml为阴性组，1.00×103拷贝/ml≤HBV DNA<5.00×104拷贝/ml为低含量组，5.00×104拷贝/ml≤HBV DNA<1.00×106拷贝/ml为中含量组，HBV DNA≥1.00×106拷贝/ml为高含量组。

表1HBV相关肝病患者基础资料

Tab.1BasicdataofpatientswithHBVrelatedliverdiseases

ObjectnCharacterizationofHBVDNA(Positive/Negative)QuantitativeanalysisofHBVDNAx±s(Copies/ml)Hepatocellularcarcinomagroup5037/133.83×105±9.33×105Benigngroup7154/171.13×107±4.47×107 Acutehepatitis1212/03.74×107±6.15×107 Chronichepatitis2118/31.85×105±6.83×104 Compensatedcirrhosis2011/91.73×105±5.57×105 Decompensatedcirrhosis1813/52.03×106±5.92×106Normalgroup200/200

2.2HBV相关肝癌sB7-H3 、IL-21的表达 见表2、3。结果表明：肝癌患者sB7-H3与IL-21均呈高水平表达，明显高于正常组(P<0.000 1)，亦高于良性组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3sB7-H3 、IL-21表达水平与不同疾病的关系

2.3.1sB7-H3 在不同肝炎疾病中的表达水平(图1) 可观察到sB7-H3 在不同肝炎疾病中呈较高水平表达，疾病组间差异有统计学意义(P<0.001，F=37.23)；不同疾病组与正常组均有统计学意义(P<0.005，t值分别为：31.18、12.22、9.93、8.89和26.20)；急性肝炎分别与其余各疾病间差异均有统计学意义(P<0.05，t分别为2.14、2.48、2.52和2.93)； 而其余各疾病间差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3.2IL-21在不同肝炎疾病中的表达水平(图2) 结果显示： 在肝炎疾病患者中，IL-21的表达呈较高水平，不同肝炎疾病间差异有统计学意义(P<0.001，F=21.33)，不同疾病组与正常组间均有统计学意义(P<0.005，t值分别为：7.22、10.67、9.88、8.70和15.34)；各疾病间差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4HBV相关肝癌患者sB7-H3 与IL-21之间的关系 经相关性分析，结果表明sB7-H3与IL-21之间呈正相关(如图3)，所得回归方程：Y=9.689x+345.725，相关系数(r)=0.475。

GroupsnsB7-H3(ng/ml)ComparedtonormalgroupF/Pt/PComparedwiththebenigngroupF/Pt/PNormal2027.43±12.64//15.94/0.000-19.97/0.000Benign71195.23±70.8415.88/0.000-19.94/0.000//Hepatocellularcarcinoma50207.60±57.1624.93/0.000-26.33/0.0003.58/0.067-1.13/0.266

GroupsCases(n)IL-21(pg/ml)ComparedtonormalgroupF/Pt/PComparedwiththebenigngroupF/Pt/PNormal20307.31±169.63//27.55/0.000-17.26/0.000Benign712217.63±935.6427.65/0.000-17.20/0.000//Hepatocellularcarcinoma502357.28±805.0134.45/0.00-15.44/0.0000.082/0.776-0.84/0.409

图1 sB7-H3 在不同肝炎疾病中的表达水平Fig.1 Expression level of sB7-H3 in different hepatitis diseases

图2 IL-21在不同肝炎疾病中的表达水平Fig.2 Expression level of IL-21 in different hepatitis diseases

2.5肝癌患者sB7-H3、IL-21表达与HBV DNA定性分组 结果显示：肝癌患者sB7-H3 与IL-21表达水平明显增高，高于正常组(P<0.001)。HBV DNA阳性组二标志物均值高于阴性组。采用独立样本检验方差方程的 Levene 检验后进行均值方程的t检验所得结果(表4)：HBV DNA定性分组间的sB7-H3 与IL-21经方差检验均无统计学意义(P>0.05)；t检验结果表明HBV DNA定性分组间的IL-21有统计学意义(P<0.005)，sB7-H3均值则均无统计学意义(P>0.05)。

2.6sB7-H3 与IL-21在肝癌患者HBV DNA定量分组中的表达状况 见图4、5，sB7-H3 与IL-21在患者各分组中表达均高于正常组(t值分别为：12.26、20.84、9.78和12.64；5.99、11.99、9.57和6.31。P均为0.000<0.001)。统计分析发现：sB7-H3表达差异在各组患者间均无统计学意义(F均为0.95，P值>0.05)；而IL-21差异有统计学意义(F=4.34，P=0.008<0.01)。除HBV DNA阴性组分别与其余各组间IL-21均值差异均有统计学意义(t值分别为：-3.367，-3.05和-2.14，P值分别为：0.002<0.005、0.006<0.01和0.045<0.05)外；而其余各组间的sB7-H3与IL-21表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 sB7-H3 与IL-21之间表达关系Fig.3 Expression relationship between sB7-H3 and IL-21

表4sB7-H3、IL-21表达与HBVDNA定性分组的关系

Tab.4RelationshipbetweensB7-H3，IL-21expressionandqualitativegroupingofHBVDNA

ProjectnsB7-H3(ng/ml)IL-21(ng/ml)Negativegroup14191.61±49.071645.74±826.12Positivegroup36213.35±44.162612.37±849.97F/P0.21/0.6470.06/0.816t/P-1.54/0.131-3.68/0.001

2.7sB7-H3与IL-21分别用于诊断HBV相关肝癌的效能分析

2.7.1以sB7-H3和IL-21的浓度为变量，正常组为参照水平做ROC曲线，研究它们在肝癌诊断中的准确性，结果如图6所示：sB7-H3、IL-21分别作为标志物对肝癌与正常组进行区分时，其AUC值分别是0.965(P=0.000)、0.975(P=0.001)，可提示二者作为血清标志物在肝癌诊断都具有统计学意义。

2.7.2以sB7-H3和IL-21浓度为变量，良性组及正常组为参照水平做ROC 曲线，观察它们在肝癌诊断中的准确性，结果如图7所示：sB7-H3、IL-21分别作为标志物对肝癌与参照组进行区分时，其AUC值分别是0.625(P=0.033)、0.639(P=0.026)，说明sB7-H3、IL-21作为血清标志物用于肝癌诊断价值较低。

图4 sB7-H3在肝癌患者HBV DNA定量分组中的均值图Fig.4 Mean map of sB7-H3 in HBV DNA quantitative grouping of patients with hepatocellular carcinoma

图5 IL-21在肝癌患者HBV DNA定量分组中的均值图Fig.5 Mean map of IL-21 in HBV DNA quantitative grouping of patients with hepatocellular carcinoma

图6 以正常组为参照的诊断肝癌ROC曲线Fig.6 ROC curve for diagnosing HCC with normal group as reference

图7 以良性组及正常组为参照的诊断肝癌ROC曲线Fig.7 ROC curve for diagnosing HCC with benign group and normal group as reference

3 讨论

B7-H3最早见于2001年Chapoval等[6]的报道，是从树突状细胞的cDNA库中克隆出的B7家族新成员，属于免疫球蛋白的超家庭成员。最近的研究[7]显示肝癌临床 TNM 分期越晚，B7-H3表达水平越高，同时肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMS )的浸润程度也越高，B7-H3 表达和TAMS 浸润在HCC病情进展中趋势一致，且均与肿瘤的侵袭、转移有关。IL-21主要是由活化的CD4+T细胞、NKT细胞和Th17细胞产生的多功能细胞因子，与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15相似，拥有相同的细胞因子受体γ链即γc。一些研究表明IL-21有着广泛的生物学功能，在各种疾病包括病毒感染中扮演着重要的角色[8]。

3.1sB7-H3与IL-21在乙肝相关肝癌患者中的表达 研究表明B7-H3在肝癌组织中表达水平高[9,10]；但sB7-H3在肝癌患者中的表达却有争议。本组结果显示HBV相关肝癌患者sB7-H3均呈高水平表达，高于正常组(P<0.001)；结果与王斐斐[11]、许文[12]一致而与李淑湘[13]不同，其差异可能与病例的选择或检测的试剂有关；本组研究中肝癌组均值最高，良性组次之，两组间差异无统计学意义。

HBV 侵入人体后引起机体免疫应答，此过程中有多种细胞因子参与免疫反应的调节，研究证实IL-21作为炎症介质，参与并影响着乙型肝炎疾病发生、发展与转归[14,15]。本组结果表明HBV相关性肝癌患者血清IL-21呈高水平表达，均值高于正常组(P<0.001)，亦高于良性组，但差异无统计学意义，与sB7-H3表达趋势一致。

近年来的报道[16,17]证实，B7-H3与IL-21之间存在关联，本组结果进一步证实了它们之间呈正相关，可推测在HBV相关肝病(癌)患者中，B7-H3与IL-21之间存在正性调节作用可能。基于肝癌患者存在免疫功能紊乱，B7-H3与IL-21持续高表达，可能与患者疾病的发展、预后有关。

3.2sB7-H3与IL-21表达水平与HBV相关的各疾病之间的关系 有关报道显示HBV患者中sB7-H3表达水平不一。本组研究表明sB7-H3在HBV相关疾病患者中的表达均有不同程度的增高，高于正常组(P<0.001)，结果与李广云[18]一致，而与李淑湘[13]的和成婧[19]的不一致。

HBV感染后，患者IL-21水平和IL-21+CD4+T 细胞升高，且与疾病的严重程度相关[20]。在CHB患者，病毒持续感染使IL-21 维持较低水平，当用干扰素和核酸类似物等药物治疗后，随着病毒清除和病毒载量下降，IL-21水平升高[21]，这可能与干扰素通过免疫调节途径参与的抗病毒效应相关[22]。 另一方面，CHB 患者的肝脏炎症和纤维化程度与组织中IL-21 的表达显著关联[23]。本组研究结果表明IL-21在HBV相关疾病中的表达水平均高于正常对照，同相关研究[24-26]一致，其中急性乙型肝炎均值最高，肝癌次之，与sB7-H3在HBV相关的不同疾病中的表达趋势一致，提示高表达的IL-21 可诱导淋巴细胞分泌炎性因子损伤肝脏[20]。

3.3sB7-H3、IL-21表达与HBV DNA的关系 本研究显示乙型肝炎患者血清B7-H3、IL-21表达水平均较高，高于正常组；进一步观察发现HBV DNA阳性的肝癌患者sB7-H3 与IL-21均值分别高于HBV DNA阴性的肝癌患者，但两组间差异均无统计学意义。在HBV DNA定量分组中，我们尝试了两种分组划分标准，但最终统计结果表明与HBV DNA定性分组一致，提示B7-H3在HBV相关性肝癌患者血清中表达水平与HBV DNA的复制与否及复制水平无明显关联性，而IL-21与HBV DNA的复制与否有关，但与复制水平无明显关联性。sB7-H3表达与前期研究[27]一致；IL-21则与姚佳燕等[28]报道不一致，这可能与研究对象状况不同有关。

3.4sB7-H3、IL-21分别诊断HBV相关肝癌的效能分析 李广云等[18]以sB7-H3浓度为变量，正常组为参照水平做ROC曲线，研究sB7-H3作为标志物在肝癌诊断中的准确性，所得结果提示sB7-H3作为血清标志物在肝癌临床诊断中有价值。

本组先以sB7-H3、IL-21的浓度为变量，以正常组为参照水平做ROC曲线，观察它们作为标志物运用于肝癌诊断中的准确性，sB7-H3、IL-21分别作为标志物对肝癌与正常组进行区分时，其AUC值分别是1.00(P=0.000)和0.978(P=0.001)。然后再以sB7-H3、IL-21浓度为变量，良性组及正常组为参照水平做ROC 曲线，结果所得AUC值分别是0.625(P=0.033)和0.639(P=0.026)，提示sB7-H3、IL-21作为血清标志物在临床诊断HBV 相关肝癌诊断价值较低。

综上所述sB7-H3、IL-21在HBV相关肝癌患者中表达水平高，且表达呈正相关；其持续高表达可能与乙型肝炎患者的疾病演变相关。而运用sB7-H3、IL-21诊断肝癌的效能结果表明它们诊断肝癌组的效能受参照对象水平影响，其在肝癌中的诊断作用尚须更多的实验和证据加以证实。

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