醛类应激介导ω-3鱼油脂肪乳剂预处理减轻大鼠脑局灶性缺血再灌注损伤的机制研究

朱斌斌 高 彬 赵清振 徐义国 吴 祥 桂 煜

随着近几年人口老龄化速度的加快以及人们生活方式的改变，缺血性脑血管疾病的发病率呈现逐年增加的趋势，该病具有较高的致残率和病死率，对患者的生命健康造成了严重的威胁［1］。目前，临床上对于缺血性脑血管疾病的治疗手段相对较少，效果也较为有限，其治疗的原则为尽早恢复缺血区的血液灌流，但部分患者再灌注后组织功能并未得到恢复，反而使结构和功能障碍进一步加重，造成了缺血再灌注损伤［2］。研究证实，大脑缺血再灌注损伤的发生、发展与醛类应激、内质网应激以及炎症应激等具有密切的关系，其成为治疗缺血性脑血管疾病的重要靶点［3］。ω-3鱼油脂肪乳剂具有一定的抗氧化、抗炎症以及减少血栓形成的作用，国外有报道称其对大鼠的肠缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，但对脑缺血性再灌注损伤是否有保护作用尚缺乏研究［4］。因此，本研究观察了ω-3鱼油脂肪乳剂对大鼠脑局灶性缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨了其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组以及药物干预 SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠40只，体重150～200g，购自中科院上海实验动物中心。置于温度（22±1）℃，湿度（60±10）%，光照（12h照明，12h黑暗交替）环境下饲养1周，自由饮水、普通颗粒饲料喂养。将40只大鼠随机分成5组，每组各8只：正常组（C组）、模型组（M组）、ω-3鱼油脂肪乳剂5d组（FOFE-5组）、ω-3鱼油脂肪乳剂10d组（FOFE -10组）、ω-3鱼油脂肪乳剂10d组（FOFE -15组）。C组和M组大鼠不做任何药物干预处理，FOFE-5组、FOFE -10以及FOFE -15组分别在手术前5d、10d、15d开始给予ω-3鱼油脂肪乳剂尾静脉注入，剂量为2ml/（kg·次·d）。

1.2 动物模型建立与评价 M组、FOFE-5、FOFE-10、FOFE -15组采用 Zea Longa线栓方法［5］建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）：术前12h大鼠禁食，自由饮水。采用10%水合氯醛腹腔麻醉，取仰卧位，颈部正中作以切口逐层切开，暴露右颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈总动脉在颈总动脉与颈外动脉中间备线（不扎紧），动脉夹夹闭颈内动脉远心端，在颈总动脉近分叉处切口，插入与血管直径相适应的线栓，收紧备线，打开动脉夹，栓线进入颈内动脉，将 4-0 单丝尼龙线在颈动脉分叉处插入颈内动脉，当进入深度约18mm时，可感到轻微阻力感，可认为栓线已阻断大脑中动脉，停止进线，扎紧备线，缝合筋膜和皮肤，术后给予滴庆大霉素注射液预防感染，注意保温使体温恒定。假手术组只分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，不结扎。24h后进行神经行为学评分，剔除死亡以及神经行为学评分为0分老鼠。

1.3 样本采集和检测 （1）神经行为评分：手术后24h，在动物处死前采用 Longa评分改良方法进行神经行为检测：未观察到神经损伤症状，为0分；悬尾试验中大鼠不能完全伸展对侧前爪为1分；大鼠的前肢抵抗对侧推力能力下降为2分；大鼠稍微向对侧转圈为3分；明显向对侧转圈为4分；行走时向对侧倾倒为5分。（2）脑梗死体积：手术后24h，将大鼠断头处死，获取脑组织后进行TCCA染色，观察脑组织的梗死体积。（3）丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LHD）水平检测：将脑组织用PBS均浆制成10%的匀浆液，离心处理取上层清液，采用酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），严格按照说明书要求测定脑组织中MDA、LHD水平，所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。（4）RTPCR方法检测脑组织中Nrf2、HO-1mRNA表达：将分离出的脑组织按照Trizol RNA 提取试剂盒说明书提取总 RNA，采用紫外吸收法测定A260nm/A280nm的比值，在1.8～2.0之间认为RNA纯度合格。使用TAKARA反转录试剂盒合成 cDNA（浓度为 50ng/μl）。加样后采用定量 PCR 仪进行反应扩增。采用Primer Premier5.0及Oligo6 软件进行引物设计Nrf2 上游 引 物 ：5'-ATCCTTTGGAGGCAAGACAT-3'， 下 游引 物 ：5'-TCCTGTTCCTTCTGGAGTTG-3'；HO-1 上游引物：5'-CAGAGTTTCTTCGCCAGAGG-3'，下游引物 ：5'-TGAGTGTGAGGACCCATCG-3'；β-actin 上游引物：5'-GCCATGATCGTAGCCATCCA-3'，下游引物5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3。PCR反应条件：95℃ 预变性 10min，95℃变性 30s，60℃ 30s，72℃延伸1min，共40个循环。所有目的基因的阈值是与内参相比较，通过计算2-ΔΔCt表示基因相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用方差（Analysis of variance，ANOVA）法；计数资料采用百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经行为评分和大脑梗死面积 C组大鼠的神经行为评分和大脑梗死面积均为0，M组大鼠出现不能完全伸展对侧前爪，或向对侧转圈或向对侧倾倒等的运动障碍，大脑的梗死面积可达（52.31±9.24）%。FOFE-5组、FOFE-10组以及FOFE-15组大鼠的神经行为评分和大脑梗死面积较M组显著降低，且FOFE-5组明显高于FOFE-10组和FOFE-15组，差异具有显著性（P＜0.05）；FOFE-10组和FOFE-15组比较无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠手术后的神经行为评分和大脑梗死体积比较（±s）

表1 各组大鼠手术后的神经行为评分和大脑梗死体积比较（±s）

注：与C组比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05；与FOFE-5组比较，△P＜0.05

组别 神经行为评分（分） 大脑梗死体积（%）C组 0.00±0.00 0 M组 4.21±0.82* 52.31±9.24*FOFE-5组 2.81±0.93*# 37.23±8.12*#FOFE-10组 2.32±0.77*#△ 31.21±9.21*#△FOFE-15组 2.27±0.84*#△ 30.44±8.67*#△

2.2 MDA和LHD水平 M组大鼠的MDA、LHD水平较C组显著升高，FOFE-5预处理使MDA水平显著降低，且FOFE-10组和FOFE-15组明显低于FOFE-5组，差异具有显著性（P＜0.05）；FOFE-10组和FOFE-15组比较无显著差异（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠手术后脑组织中的MDA和LHD水平比较（±s）

表2 各组大鼠手术后脑组织中的MDA和LHD水平比较（±s）

注：与C比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05；与FOFE-5组比较，△P＜0.05

组别 MDA（U/g） LHD（mmol/g）C组 1.79±0.08 613.27±131.27 M组 3.47±0.81* 924.23±108.12*FOFE-5组 2.53±0.77*# 752.73±114.81*#FOFE-10组 2.32±0.88*#△ 711.27±115.81*#△FOFE-15组 2.28±0.84*#△ 706.44±120.78*#△

2.3 Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量 与C组比较，M组的大鼠脑组织中Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量明显升高，FOFE-5预处理组的Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量较M组明显升高，差异具有显著性（P＜0.05）；FOFE-10组和FOFE-15组比较无显著差异（P＞0.05），见表 3。

表3 各组大鼠脑组织中Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量（±s）

表3 各组大鼠脑组织中Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量（±s）

注：与C比较，*P＜0.05；与M组比较，#P＜0.05

组别 Nrf2 HO-1 C组 0.392±0.017 0.132±0.053 M组 0.537±0.048* 0.271±0.056*FOFE-5组 0.582±0.052*# 0.424±0.046*#FOFE-10组 0.608±0.021*# 0.463±0.057*#FOFE-15组 0.621±0.0754*# 0.462±0.051*#

3 讨论

Zea-Longa线栓法是通过线栓将脑动脉的绝大部分血流阻断，并通过定位栓线定向闭塞与基底节区皮质层血流，病理过程与缺血性脑卒中具有较好的相似性，且该方法操作简单，重复性好，在脑缺血疾病的动物实验中得到了广泛的应用［6］。为探究ω-3鱼油脂肪乳剂预处理对缺血性脑卒中的治疗作用，本研究以此法建立了MCAO模型，探究了不同处理时间对大鼠神经行为以及大脑梗死面积等的影响，分析了其相关机制。

本研究结果发现，M组大鼠的神经行为平均评分为（4.21±0.82）分，大脑梗死面积为（52.31±9.24）%，与C组具有显著差异，说明作者已成功建立MCAO模型。采用ω-3鱼油脂肪乳剂预处理后，大鼠的神经行为评分和梗死面积均显著的降低，提示ω-3鱼油脂肪乳剂预对大脑局灶性缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。而FOFE-5组明显高于FOFE-10组和FOFE-15组，且FOFE-10组和FOFE-15组比较无显著差异，说明对大鼠进行预处理10d即可达到最佳效果。

大量的研究已经证实，氧化应激在大鼠脑缺血灌注损伤的发生发展中起到了重要的作用。在大鼠发生血流再灌注时，会促使体内氧自由基的产生，对缺血损伤区的不饱和脂肪酸双链结构的生物膜造成破坏，从而损伤周围细胞细胞膜的结构和功能的完整性，诱导或引发脑组织缺氧。MDA是一种醛类物质，是脂质过氧化最终产物，其可以间接的反映氧自由基的代谢能力以及组织氧化性损伤程度［7］。LDH是神经细胞在受到氧自由基攻击后发生脂质过氧化损伤而产生的，是评价氧自由基损伤程度的敏感指标［8］。本研究的结果发现，M组大鼠的MDA、LHD水平较C组显著升高，FOFE-5组预处理使MDA、LHD水平显著降低。作者认为，ω-3鱼油脂肪乳剂预处理通过醛类应激介导降低对脑组织的氧化性损伤，对大脑局灶性缺血再灌注起到保护作用。因此，ω-3鱼油脂肪乳剂预处理对脑局灶性缺血再灌注的保护作用与氧化应激具有密切关系，这与目前大部分的研究结果是一致的。

Nrf2是一种重要的氧化应激反应调节因子，激活其可以上调HO-1等蛋白的表达，减少氧化性损伤［9］。Nrf2/HO-1是调节机体抗氧化应激反应的重要信号通路，在正常机体中，Nrf2多存在于细胞质内，处于失活状态，半衰期较短，一旦激活可迅速经泛素蛋白酶体途径降解。当机体遭受氧化应激损伤时，Nrf2会迅速被激活，并发生核转位，进入细胞核，形成半衰期较长的稳态 Nrf2，抵抗机体氧化应激反应；HO-1 作为诱导型酶，广泛表达于脑组织中，在脑缺血时呈高表达状态，可增强机体的抗氧化能力，减轻缺血再灌注损伤。本研究结果发现，M组大鼠的Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA的表达量明显高于M组，而 FOFE-5组预处理后进一步使Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA的表达量升高。在脑组织发生局灶缺血性再灌注损伤时，为适应缺血缺氧等应激刺激，Nrf2/HO-1通路被激活，启动了抗氧化蛋白 HO-1的表达，对抗缺血缺氧引起的脑组织损伤［10］。而ω-3鱼油脂肪乳剂预处理进一步促进了Nrf2蛋白的合成，进一步激活Nrf2/HO-1通路，发挥抗氧化作用。因此，ω-3鱼油脂肪乳剂预处理对脑局灶性缺血再灌注的保护作用可能与Nrf2/HO-1通路有关。

综上所述，ω-3鱼油脂肪乳剂预处理通过调节醛类应激介导的氧化应激以及Nrf2/HO-1信号通路，对大鼠大脑局灶性缺血再灌注损伤起到了保护作用，其为临床缺血性脑卒的治疗提供了一种新思路。

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［4］ 何林秀,孙明立,边竞,等．ω-3鱼油脂肪乳对环磷酰胺所致小鼠胃黏膜损伤的保护作用．中国医科大学学报,2015,44(12):1090-1093．

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