姜黄素脂质纳米粒对人脐静脉内皮细胞细胞因子表达的影响

刘佳 闫昭芫 郑思彤 甘力 柴惠★

动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）致心血管疾病占当代城乡居民总死亡原因的首位，严重威胁人类的生活质量，缩短预期寿命［1］。近年来，随着纳米颗粒生物学效应和安全性研究的不断深入，纳米颗粒与药物结合用于疾病的治疗被认为是可行的［2］，心血管系统也逐渐被认为是纳米材料与药物接合作用有效应靶点之一［3］。姜黄素是从姜科植物根茎中提取的酚性物质，目前研究表明姜黄素在体外良好的抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用。是一种已证实具有疗效的传统中药［4］。但因姜黄素极性小难溶于水、生物半衰期短、稳定性差、代谢消除速率快的特点，导致在临床上应用受到限制［5］。本实验利用脂质体作为纳米材料包被姜黄素。脂质体的体内代谢产物为大豆卵磷脂，在临床上已证实其大剂量安全性［6］。本研究旨在观察姜黄素纳米新剂型对ICAM-1的表达以及NO生成有无影响，进一步丰富其在抗动脉粥样硬化中的药理使用方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 HUVEC细胞购自中国科学院细胞库、DMEM培养基（美国Gibco公司）、胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；PBS溶液、胰酶-EDTA（均购自吉诺生物医药技术有限公司）；TNF-α、大豆卵磷脂、胆固醇（均购自美国Sigma公司）；MTT 染料（上海拜力生物科技有限公司）；NO试剂盒、ICAM-1 ELISA试剂盒（均购自南京建成生物工程研究所）；逆转录试剂盒（美国Ferments公司）、PCR marker（日本Takara公司）。PCR仪（美国Bio-Rad公司，CFX96Touch）； 680型酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 药剂制备 采用薄膜-超声法制备。精密称取大豆卵磷脂和胆固醇，以一定的比例混匀加入具塞三角瓶中，加入15ml氯仿使其溶解，随后用旋转蒸发仪氯仿蒸发，可逐渐观察到瓶壁内形成的一层均匀脂膜。继续干燥，待氯仿全部挥发，加入15ml乙醚溶解脂膜。随后加入含姜黄素的乙醇溶液5ml，于恒温振荡器内充分振荡混合，借助超声仪上超声成油包水型乳剂。静置30min后利用旋转蒸发仪蒸发去除有机溶剂，可观察到瓶壁上形成的凝胶，继续旋转蒸发使凝胶脱落。最后，加入pH6.8的PBS溶液50 ml使凝胶溶胀，即得到脂质体的混悬液。一切操作之前所有器材均照射紫外光30min，结束操作后姜黄素脂质纳米粒经0.45μm滤菌器过滤，4℃冰箱保存。

1.3 细胞培养 设定培养箱温度恒温37℃、5% CO2和95%空气饱和湿度。将第6代HUVEC稳定细胞株接种至6孔板，添加含10%FBS的DMEM培养液，待细胞密度达75%～85%时，换成含0.5% FBS的DMEM饥饿培养8h后加药处理。细胞分成6 组：空白对照组（正常生长，不用任何药物处理）、TNF-α模型组（加入10μg/L TNF-α培养6h）、纳米结构脂质载体空药物组（用不含药物的纳米空颗粒30μg/ml预处理1h后，再直接与1μg/L TNF-α反应6h）、TNF-α+不同浓度姜黄素纳米颗粒药物组3组（5mg/L、15mg/L、30mg/L，分别预处理1h后再加入10μg/L TNF-α共培养 6h）。

1.4 MTT法检测姜黄素脂质纳米粒对HUVEC细胞增殖的影响 取对数生长期的HUVEC 细胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，反复吹打后将细胞接种于96孔板，每孔容积200μl，待细胞融合至70%～80%时，换为无血清DMEM培养液培养12 h，使细胞生长同步于G0/G1 期，作用时间分别为6h，12h，24h，每孔加入5mg/L MTT溶液20μl，4h后吸弃上清液，每孔加入DMSO 200μl溶解结晶物，振荡10min。在酶标仪490 nm 处测定各孔的吸光值（OD 值）。并按照以下公式计算各组细胞生存率。

1.5 实时荧光定量PCR 用Trazol法提取各组细胞RNA，按照逆转录合成试剂盒说明逆转录成cDNA。用实时定量PCR仪器检测基因表达量。使用96孔板，每组设立至少三个平行重复样。每孔为20μl反应体系， 包 含 ：SYBR Fast qPCR Mix（2X），10μl；PCR Forward Primer（10μm），0.8μl；PCR Reverse Primer（10μM），0.8μl；DNA 模 板，2μl；ddH2O，6.4μl。反应条件：95℃，5min；95℃，20s；55℃，30s；72℃，10min，共35个循环，最后72℃反应10min。每个样品按相同条件重复3次，与内参GAPDH均一化消除实验误差后取平均值。引物由上海生工生物工程公司合成，如下表：

eNOS 引物序列

1.6 ELISA检测各组细胞培养液上清中ICAM-1的蛋白水平 各组按不同药物处理后，细胞用无菌预冷PBS漂洗3次，分别加入100μl 80%乙醇，使乙醇均匀分布在每孔孵育10min以固定细胞；再经PBS洗涤后，3% BSA室温封闭1h；加入ICAM-1抗体50μl（稀释倍数：1：500），于37℃室温孵育 1h；TBST洗涤10min 重复3次，孵育二抗。加入显色剂100μl，37℃避光15min，加入终止液终止反应，用酶标仪于490nm处读取吸光值。

1.7 检测血清NO含量 吸取细胞培养上清液，采用偶氮化合物硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO含量。NO在氧气和水存在条件下生成硝酸盐与亚硝酸盐，后二者在硝酸盐显色剂作用呈淡红色，通过比色法得到NO含量。（参照南京建成生物工程研究所提供的NO试剂盒使用说明书）。

1.8 统计学方法 采用SPSS 13. 0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药剂制备 与纯水比较姜黄素脂质纳米粒剂型澄清透明，无任何沉淀。透射电子显微镜下纳米结构粒径约为150～200nm。制剂成功。

2.2 MTT法检测不同浓度姜黄素脂质纳米粒对细胞存活率的影响 见表1。

表1 不同浓度药物处理对细胞存活率的影响

2.3 不同药物处理组对HUVEC细胞ICAM-1 mRNA的表达 与空白对照组比较，模型组TNF-α显著促进ICAM-1表达（P＜0.01），而姜黄素纳米结构脂质载体可显著抑制由其诱导的ICAM-1表达量增加（P＜0.01）。

2.4 eNOS的基因表达 结果显示，比较较于空白对照组，模型组TNF-α显著降低eNOS表达（P＜0.01），而姜黄素纳米结构脂质载体可显著升高由其诱导的eNOS 表达量增加（P＜0.01）。

2.5 Elisa 不同浓度姜黄素脂质纳米粒对HUVEC细胞ICAM-1分泌的影响 见表2。

表2 不同药物处理组对HUVEC细的ICAM-1表达量

2.6 NO表达量 与空白对照组比较，模型组在TNF-α作用下，NO表达量明显下降（P＜0.01）。而姜黄素纳米结构脂质载体可促进细胞分泌的NO的增加（P＜0.01）。

3 讨论

纳米材料是三维空间尺寸至少有一维处于纳米量级（1～100nm）的材料。这些合成的颗粒（一般是来自于聚合物，脂质或金属），这些小颗粒物能够与治疗药物偶联在体内进行运输，从而运送至指定部位并得到富集［7］。其可降解的外壳可以帮助药物在到达指定部位后缓释［8］。同时，血管内皮细胞作为致密的组织屏障，其本身生理学作用决定其对外界物质吸收率低。纳米载体使得药物靶向并有助于随后的渗透进入或穿过内皮，提供由它们的非靶向对应物无法实现的治疗效果。姜黄素脂质体纳米颗粒的优势在于改变难溶药物因极性原因难以到达病灶发挥药效的缺点。

一氧化氮合酶（eNOS）功能障碍与AS发生、发展有着密切联系，起到根本性作用。随着动脉粥样硬化病情逐渐发展，内皮功能障碍，内皮细胞释放的具有血管松弛作用和抗AS的主要分子NO合成和释放减少，内皮细胞表面表达的粘附分子与流经血液中的各型白细胞结合，释放水解酶、细胞因子等促使炎症细胞进入血管上皮层内，引发炎症反应发生、斑块进一步生长，加重病情。NO能够起到血管扩张作用，调控血小板聚集、单核巨噬细胞浸润以及血管平滑肌细胞增殖等，对AS的发展过程中起到负性调节作用，具有积极生理意义。本实验证明，姜黄素脂质纳米粒对于TNF-α引发的炎症损伤作用下细胞分泌NO是有积极作用的。

同时，粘附分子表达量的降低，促使单核细胞向血管内膜转移是动脉粥样硬化病变的早期阶段。ICAM-1（CD54）属于免疫球蛋白超家族粘附分子，是一种单链跨膜糖蛋白，在白细胞与血管内皮细胞稳定粘附中发挥重要作用。若在炎症环境中内皮细胞表达量上升，则血管内皮细胞进一步向血管周围浸润，组织的炎症和相应的损害逐步加重。本实验结果表明，新剂型通过影响对血管内皮细胞粘附分子的分泌抑制病情的恶化，发挥药用作用。

［1］ Benjamin Emelia J, Blaha Michael J, Chiuve Stephanie E, et al．Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association． Circulation, 2017: e1-e458．

［2］ Buxton Denis B． Nanomedicine for the management of lung and blood diseases． Nanomedicine (Lond), 2009, 4(3): 331-339．

［3］ Cheraghi Mostafa, Negahdari Babak, Daraee Hadis, et al． Heart targeted nanoliposomal/nanoparticles drug delivery: An updated review． Biomed． Pharmacother, 2016, 86: 316-323．

［4］ Dadkhah Tehrani Abbas, Parsamanesh Masoumeh． Preparation,characterization and drug delivery study of a novel nanobiopolymeric multidrug delivery system． Mater． Sci． Eng． C． Mater． Biol． Appl,2017, 73: 516-524．

［5］ Rachmawati H, SI Surya, KN Fisheri, et al． In Vitro Study on Antihypertensive and Antihypercholesterolemic Effects of a Curcumin Nanoemulsion． Sci Pharm, 2016, 84(1): 131-140．

［6］ Zheng Y, Stephan MT, Gai SA, Abraham W, Shearer A, Irvine DJ．In vivo targeting of adoptively transferred T-cells with antibodyand cytokine-conjugated liposomes． J． Control Release, 2013,172(2): 426-435．

［7］ H Rachmawati, DK Budiputra, R MauludinBudiputra． Curcumin nanoemulsion for transdermal application: formulation and evaluation． Drug Dev Ind Pharm, 2015, 41(4): 560-566．

［8］ Von Roemeling C, Jiang W, Chan CK, et al． Breaking Down the Barriers to Precision Cancer Nanomedicine． Trends in biotechnology, 2016: e1-e12．