傣药对叶豆叶山柰酚的含量测定

　　　　

姜明辉 西双版纳州食品药品检验所，云南　景洪　666100

傣药对叶豆叶为豆科植物翅荚决明CassiaalataLinn.的干燥叶，西双版纳傣医称“芽拉勐龙” ，其味淡，性寒，入水塔。具有清火解毒，消肿止痛，杀虫止痒之功。用于风火水毒过盛所致的咽喉肿痛，口舌生疮；疔疮肿痛，疥癣，湿疹；六淋证出现的尿频、尿急、尿痛；痔疮出血；腹泻，痢疾；骨折[1]。文献报道[2]其叶含有金圣草素、山柰酚、槲皮素、5,7,4＇-三羟基二氢黄酮等黄酮类成分，标准收载于《云南省中药材标准》(2005年版第三册·傣族药)。目前，未见对叶豆叶山柰酚含量测定的报道，按《中国药典》2015年版四部通则[3]现建立对叶豆叶山柰酚含量测定方法，为对叶豆叶质量标准的提高提供参考方法和依据。

1　仪器与材料

1.1仪器Agilent高效液相色谱仪(G4214B-1260DAD；G1316A-1230TCC；G1329-1260ALS；G1311C-1260 QuatpumpVL)；岛津UV-2550紫外可见光分光光度计；101-EBS电热鼓风干燥箱。

1.2材料不同产地的五批药材于2014年2月至10月分别采自西双版纳州景洪市、勐海县、勐腊县。详见表1。由西双版纳州食品药品检验所彭霞主任药师鉴定为豆科植物翅荚决明CassiaalataLinn.的干燥叶。

山柰酚对照品(批号：110861-201310，中国食品药品检定研究院，含量按93.2%计)。甲醇、乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；水为超纯水(自制)。

2　方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性考察色谱柱：Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：乙腈-0.1%甲酸(22∶78)；流速：1 mL/min；检测波长：366 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；理论板数以山柰酚计应不低于3000。如图1、2所示。

2.2对照品储备液的制备精密称取山柰酚对照品适量，置于100 mL量瓶中，用甲醇制成每1 mL含30μg的溶液，摇匀，即得。

2.3供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)45min，放冷，再称定重量，用80%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4线性关系考察精密量取山柰酚对照品储备液(浓度为376.714 40μg / mL)，配制成浓度分别为376.71440、301.37152、263.70008、207.19292、150.68576、103.59646、75.34288、60.27430、45.20573、30.13715、22.60286、15.06858、10.54800、3.01372μg /mL的对照品溶液，分别进样10 μl ，以进样浓度Y(μg /mL)为横坐标，峰面积X为纵坐标，经回归处理，回归方程：Y=39.522x-15.458，r2=0.9999，试验结果表明山柰酚在3～200μg范围内的线性关系良好。

2.5精密度试验取6份对叶豆叶药材(西双版纳勐腊县勐仑镇，批号：20140831)，精密称定，按“2.3”项下方法操作，依次测定，对叶豆叶药材的平均含量为0.148%，RSD为0.36%。

2.6重复性试验精密量取2.2 项下对照品液10μL，按照上述色谱条件连续进样7次，以峰面积值计算RSD为1.04%，结果符合要求。

2.7稳定性试验取同一批次的供试品溶液(产地：西双版纳州勐腊县勐仑镇，批号：20140831)，在0、2、6、12、18、24 h进样测定，测得山柰酚峰面积的RSD为1.44%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8加样回收率试验取具塞锥形瓶6个，分别精密加入山柰酚对照品0.40 mg精密称取已知含量的样品(西双版纳勐腊县勐仑镇 批号：20140831)0.25 g，分别加入上述6个具塞锥形瓶中，按“2.3”项下方法操作，按上述色谱条件测定，计算回收率。该分析方法的回收率为97.42%～102.99%，且RSD为1.64%，符合要求。

2.9样品测定取不同产地5批对叶豆叶，按照上述方法制备供试品溶液，分别测定西双版纳州内5批样品，按干燥品计算本品的含量，测定结果见表1。

表1　不同产地对叶豆叶山柰酚的含量　(n=2)

3　讨论

3.1检测波长的选择取山柰酚对照品溶液，在190 ～ 400 nm的范围内扫描，结果山柰酚在365.6 nm、325.10 nm、266.10 nm处有吸收峰。其他条件不变的情况下，根据山柰酚在二极管阵列检测器上得到的紫外吸收光谱图，366 nm峰面积比325 nm、266 nm峰面积大；分离效果更好。因此确定该方法的测定波长为366 nm。

3.2流动相的选择以乙腈-0.1%甲酸(22∶78)、乙腈-0.2%磷酸(32∶68)、甲醇-0.1%甲酸(22∶78)、甲醇-0.4%磷酸(50∶50)、甲醇-0.4%磷酸-四氢呋喃(40∶50∶10)为流动相依法测定，结果以乙腈-0.1%甲酸(22∶78)为流动相，各组分分离好，基线较稳定。

3.3提取条件的考察实验考察了甲醇、乙醇、80%乙醇、70%乙醇、60%乙醇为溶剂，采用回流提取(提取时间为60 min、90 min、120 min)、超声处理(超声时间为30 min、45 min、60 min)制备供试品溶液。结果表明，以80%乙醇为溶媒，超声处理45 min，对叶豆叶中山柰酚的溶出量最大。

3.4耐用性试验按《中国药典》2015年版第四版通则9101 “药品质量标准分析方法验证指导原则”，考察了不同柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、不同生产厂家的色谱柱(依利特 Hypersil ODS2(150×4.6 mm, 5.0 μm)、Agilent C18(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm))、不同检测波长(361 nm、366 nm、371 nm)、不同流速(0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min)，结果表明，上述因素对保留时间有明显影响，但对峰面积积分值无明显影响，对被测成分色谱峰的分离度、拖尾因子无明显影响。

综上，本文建立HPLC法测定对叶豆叶中山柰酚的含量方法，同时测定了对西双版纳州景洪市、勐海县、勐腊县五个产地五批对叶豆叶药材含量，结果显示，各个产地的含量有差异。此方法经方法学验证，可为对叶豆叶药材标准的进一步提高，提供方法依据。

[1]云南省食品药品监督管理局.云南省中药材标准(第三册)[M].昆明：云南科技出版社，2005：37.

[2]刘安，徐丽珍，邹忠梅，等.对叶豆黄酮类化学成分研究[J]. 中国中药杂志，2009，34(7):861-863.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[M].北京：中国医药科技出版社，2015：374-377.