贵州芒果畸形病病原菌的分离与鉴定

赵玳琳，王 廿，卯婷婷，陶 刚

(贵州省农业科学院植物保护研究所，贵州 贵阳 550006)

【研究意义】芒果(MangiferaindicaL)属漆树科(Anacardiaceae)芒果属(Mangifera)，是世界第二大热带水果[1]。其在我国海南、云南、广西、福建、广东、四川、台湾和贵州等热带及亚热带地区均有种植[2]。贵州省地处我国南亚热带北缘地区，是国家农业部确定的全国9个南亚热作省区之一，适宜南亚热作生产的土地面积达108.9万hm2，芒果适宜种植区面积10.5万hm2，可发展种植面积5.3万hm2，优势区面积2.3万hm2，其中，南、北盘江及红水河流域低海拔河谷地区(E104°14′～107°06′、N24°32′～25°52′)具备芒果种植的自然气候及土壤条件[3]。芒果畸形病(mango malformation disease)是一种严重的世界性病害，1891年在印度首次被发现[4]，目前在非洲(埃及、南非、苏丹、斯威士兰和乌干达)、美洲(巴西、萨尔瓦多、墨西哥、尼加拉瓜、委内瑞拉和美国南部的佛罗里达州)、亚洲(印度、马来西亚、缅甸、巴基斯坦和中国南部)、欧洲(西班牙南部)和中东(以色列和阿曼)等地广泛分布[5-14]。在我国，芒果畸形病主要分布在云南和四川海拔较高的种植地区，且有进一步蔓延的趋势[15-17]。该病害主要引起营养器官和花序畸形，致使花序坐果后不育或败育而导致减产，平均产量损失达50 %～80 %，严重时绝产[18-19]。【前人研究进展】芒果畸形病的病因在学术界一直存在争论，病因主要包括生理失调[20-21]、营养因素[22]、植原体[23]、病毒理论[24-25]、瘿螨危害[26-27]和真菌侵染等[28-29]。自20世纪80年代以来，越来越多的研究结果表明，该病主要由镰刀菌(Fusariumspp.)引起，不同地区病原镰刀菌种类有所不同，目前报道引起该病的病原菌主要有F.subglutinans、F.mangiferae、F.proliferatum、F.sterilihyphosum、F.mexicanum和F.tupiense[30-33]。【本研究切入点】黄海等[34]在贵州省兴义市调查发现芒果畸形病的发生；贵州省植物保护研究所生物防治实验室于2016年3月在贵州省兴义市南盘江地区芒果种植园调查发现该病普遍发生，且对芒果的产量和品质造成严重影响，但目前尚未见有关贵州芒果畸形病病原菌准确鉴定的报道。因此，准确分离和鉴定是该病害科学防控的关键。【拟解决的关键问题】通过对贵州省兴义市山地芒果基地发生芒果畸形病的病原菌进行分离、致病性测定、形态学观察及rDNA-ITS序列分子系统学鉴定研究，以明确该病病原菌种类，为其科学有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

(1)病原菌。具有芒果畸形病典型症状的芒果花序，2016年3月采集于贵州省兴义市南盘江镇田房村山地芒果种植园(N 24°52′21″，E 104°58′53″)。

(2)培养基。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，马铃薯葡萄糖培养基(PDB)。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌分离 采用方中达[35]的组织分离法分离病原菌。选取具有典型病害症状的芒果花序组织，用自来水轻轻冲洗干净，在病健交界处切取面积约2 mm×2 mm的病害组织块，用70 %的医用酒精表面消毒20 s，再用5 % NaClO消毒30～60 s，无菌水冲洗3次，每次20 s，然后将组织块接种于PDA培养基平板上，置于25 ℃、12 h光暗交替条件下培养，直至长出菌落。取菌落边缘的菌丝进行继代纯化培养3代后保存于PDA斜面试管中，置4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2 致病性测定 (1)离体接种。采用健康的芒果果实进行菌丝块接种。果实经70 %酒精表面消毒后用无菌水冲洗去除残留酒精，置于铺有湿润吸水纸的塑料盘中待用。将在PDA平板上25 ℃培养5 d后的病原菌菌落边缘打取直径为5 mm的菌丝块接种于果实上，每个果实接种2块，6次重复，以接种空白培养基块作为对照，用保鲜膜封住塑料盘保湿，置于25 ℃恒温培养箱中12 h光照条件培养，分别于接种后1、3、5和7 d观察记录果实发病情况。

(2)活体接种。采用分生孢子悬浮液接种。将分离纯化的菌株菌丝块在PDB培养液中常温振荡培养(160 r/min)，5 d后过滤除菌丝体，配置成浓度为106个/mL的分生孢子悬浮液，在3年生健康芒果花序上用喷壶喷洒分生孢子悬浮液，3次重复，以喷洒清水为对照。接种后观察记录花序发病情况。

1.2.3 病原菌再分离 从接种发病果实和花序病健交界处分别剪取约2 mm×2 mm的病组织，按照上述组织分离法对致病菌进行再分离并进行种类鉴定，完成柯赫氏法则验证。

1.2.4 病原菌形态学观察 将纯化后的病原菌接种至PDA培养基，25 ℃黑暗培养5 d，观察菌落及菌丝的颜色和形状，镜检分生孢子的形状、产孢结构及是否产生厚垣孢子等，分别测量50个大分生孢子和小分生孢子的大小，并显微照相。参照文献[36]的方法对分离病原物进行形态学鉴定。

1.2.5 ITS 序列分析及系统发育树的构建 应用CTAB法提取病原菌基因组DNA，利用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1(5′-TCCGI.AGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对病原菌rDNA上的ITS区域进行PCR扩增[37]。ITS的PCR反应体系：灭菌超纯水9.5 μl，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μl，ITS1 1 μl，ITS4 1 μl，DNA模板1 μl；扩增条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，由上海生物工程股份有限公司测序。

通过 Clustal-X 1.81软件包[38]对所获得的菌株MGXJB-1 ITS系列与GenBank数据库中相似真菌ITS系列进行比对，再运用 BioEdit version 5.0.6对比对的结果进行手工校正，采用PAUP* 4.0 beta 10 软件对系列数据进行最大简约法分析，以启发式搜索获得系统发育树，应用树二等分再连接法作为启发式搜索的算法。在系统进化分析中碱基序列间空缺(Gaps)作为碱基缺失处理，所有碱基状态视为无序，不加权处理，经1000次重复计算自展检验值标记在分支上。

A:芒果畸形病害花序；B和D:致病性检测的果实空白培养基对照和花絮清水对照；C和E:接种致病的果实和花序A.The inflorescence of mango infected with malformation disease; B and D.CK for fruit and CK for inflorescence; C and E.The fruit and inflorescence inoculated with pathogen MGXJB-1图1 菌株MGXJB-1的致病性Fig.1 Pathogenicity of MGXJB-1 strain

2 结果与分析

2.1 芒果畸形病的病原菌及其致病性

2.1.1 病原菌 从采集的具有典型畸形症状病株的芒果花序(图1A)样品中分离到2种不同菌落特征的真菌，命名为MGXJB类型菌株和MGXJBO类型菌株，从MGXJB类型真菌分离纯化获得菌株1株，编号为MGXJB-1；从MGXJBO类型真菌分离纯化获得菌株2株，编号为MGXJBO-1和MGXJBO-2。2种类型真菌分离率均为22.2 %。

2.1.2 致病性 对3株菌株的致病性进行测定：①果实接种菌株MGXJBO-1和MGXJBO-2均未出现病害症状，而接种菌株MGXJB-1 3 d后即可发病，发病率为100 %，5 d后病斑扩大，病斑为圆形水渍状病斑(图1 C)，空白对照组未发病(图1B)。对接种发病果实病健交界处组织进行分离发现，所得菌株与原接种菌株形态一致。②芒果花序接种菌株MGXJBO-1和MGXJBO-2不能致病，而接种菌株MGXJB-1 15 d左右植株花序即可发病，花轴变短变粗变褐，花序部分畸形，接种30 d左右，发病花序畸形并枯死(图1 E)，喷洒清水对照组未发病(图1 D)。取接种发病花序病健交界处组织分离获得的菌株与原接种菌株形态一致。因此确定，MGXJB-1类型菌株为芒果畸形病的致病菌。

2.2 病原菌株MGXJB-1的形态学特征

菌株MGXJB-1在PDA培养基上25 ℃光暗交替培养5 d后菌落直径达(5.38±0.07)cm，菌落呈圆形，边缘整齐，基部无色素沉着，菌落背面略带黄色(图2A和图2B)，气生菌丝棉絮状，显微特征具有隔膜和分枝，分枝较细，直径为 2～5 μm(图2H)。产孢细胞着生于瓶状小梗上，单瓶梗、双瓶梗或复瓶梗，较长，瓶状小梗细小，近圆柱形(图 2E～G)；PDA培养基上产生大量的大型分生孢子，大型分生孢子散生于分生孢子梗上，纺锤形至镰刀形，两端较钝，顶细胞略弯曲，基细胞钝圆形或足跟不明显，整个孢子形态较短、较粗，多数具3～5个隔膜，大小为(30.01±2.93)μm×(5.73±0.66)μm(图2D)；小型分生孢子数量较少，多假头状着生于单瓶梗上，多为卵圆形、肾形和柱形等，大多单胞，极少数有1个隔膜，大小为(8.22±1.69)μm×(4.38±0.82)μm(图2C和图2D)，培养过程未见厚垣孢子，未见有性态和菌核产生，形态学特征与腐皮镰刀菌(F.solani)特征一致。

2.3 病原菌株MGXJB-1的ITS序列测定与系统发育学

通过PCR扩增菌株MGXJB-1的ITS序列全长，根据ITS系列构建了镰刀菌属部分种类的分子系统发育树(表1，图3)。系统发育树的拓扑结构中有2个镰刀菌属种的平行分支，其中，第一个平行分支包含2个近缘的镰刀菌属种类，病原分离物菌株MGXJB-1和腐皮镰刀菌(F.solani)聚为一类(支持强度为88 %)，将其鉴定为腐皮镰刀菌。同时，与F.equiseti相比，MGXJB-1和F.keratoplasticum有较近的亲缘关系。菌株MGXJB-1在分子系统树中与其他镰刀菌属种类的系统发育关系与形态学鉴定结果一致。

A～B:培养7 d的PDA菌落正面(A)和菌落背面(B)；C:小型分生孢子假头状着生于单瓶梗上；D:分生孢子；E～G:分别为大型分生孢子梗、单瓶梗(E)，双瓶梗(F)，复瓶梗(G)；H:菌丝。标尺=25 μmA-B.Front side(A) and reverse side(B) of colonies cultured on PDA after 7 d; C.False heads of microconidia grown on monophialides; D.Conidia; E-G.Monophialide(E)，double monophialides(F) and multphialide(G); H.Hyphae. Scale=25 μm图2 菌株MGXJB-1的形态学特征Fig.2 Morphological characteristics of MGXJB-1 strain

菌株Strain种名Speciesname地理来源GeographicoriginGenBank登录号GenBankaccessionNo.Zbf-R4F.solaniChinaKX079482G6F.solaniChinaMF800959TVD_Fungal-Culture132F.solaniCanadaKF494130Zbf-R15F.solaniChinaKX064991UOA/HCPFAB90F.keratoplasticumGreeceKC254052HSf5F.keratoplasticumSaudiArabiaKR425650ATS53F.keratoplasticumIndiaKY436176IFM63624F.keratoplasticumJapanURLLC184267IFM57371F.keratoplasticumJapanURLLC184241G328F.equisetiUSAKR094440286-09F.equisetiSerbiaJQ41210932F.equisetiSouthAfricaKY318493MM11F.equisetiSpainKX343174CPC26370F.sarcochroumNetherlandsLT746256

3 讨 论

芒果畸形病由镰刀菌引起，目前经过柯赫氏法则验证的有F.subglutinans、F.mangiferae、F.proliferatum、F.sterilihyphosum、F.mexicanum和F.tupiense[30-33]。有研究报道，我国芒果畸形病病原菌主要有F.mangiferae和F.proliferatum，其他病原菌未见报道[39]。该研究对贵州省兴义市的芒果畸形病病原菌进行分离鉴定表明，该病原菌为F.solani。Liew等[40]在芒果植株中分离得到F.solani，但最后证明不是芒果畸形病致病病原菌。F.solani是一种世界性分布的真菌种类，其可以作为腐生菌普遍存在于土壤、植物病残体内，同时也能使许多植物致病，如侵染豆科植物(如黄豆、豌豆、豇豆、大豆等)和林木(如核桃、梨树、国槐)引起植株根腐，还能侵染一些热带果树造成溃疡和顶端枯死症状，如鳄梨和柑橘[36,41-43]。该研究结果是国内首次发现F.solani能够引起芒果畸形病害。

根据ITS序列构建的最大简约树，以F. sarcochroum为外群(TL=100，CI=0.98，HI=0.02，RI=0.99)，分支上显示的是展检验值等于或大于50 %(1000次重复)The structured the maximum parsimony tree according to ITS sequence based on F. sarcochroum(TL=100，CI=0.98，HI=0.02，RI=0.99). The number on branches indicates the test value with equal to or greater than 50 %(1000 repetitions)图3 菌株MGXJB-1与相关种的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of MGXJB-1 strain and related species

印度和墨西哥等国对芒果畸形病的流行特点研究表明，气候条件与芒果畸形病的发生关系密切，气温较低的种植区发病较严重[39]。贵州气候属于亚热带湿润季风气候，年平均气温15 ℃左右[44]，有利于该病害发生。喻群芳等[40]应用 Max Net 3.3.3.e 和Arc GIS9.3软件对芒果畸形病在中国的潜在适生区进行预测表明，广西、云南、海南、广东、台湾和贵州等省区均为该菌的潜在适生区。目前，我国只在进口巴基斯坦芒果植物检验检疫要求中将芒果畸形病病原菌F.subglutinans列为检疫性有害生物[39]。但该研究结果表明，F.solani能够引起芒果畸形病害，鉴于该病害传入我国的风险高性，建议扩大对芒果畸形病原种类如F.solani的检疫，并加强检疫措施，从而有效控制该病害的传入和进一步扩散；同时，要积极开展芒果畸形病研究工作，建立芒果畸形病检测和鉴定体系，结合我国国情制定相应的监测、检疫及防控等相关方案，以达到及时发现与防控的目的。

4 结 论

贵州省兴义市芒果畸形病害的病原菌为腐皮镰刀菌(F.solani)，该病原菌为新发现的芒果畸形病致病菌。

致谢:在病害调查、试验材料采集和活体接种方面得到贵州省植物保护研究所叶照春和李鸿波老师的指导和帮助，特此感谢！

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