18 F-FDG PET/CT显像评价二甲双胍对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

苏航 田毅 朱紫薇 李珺奇 杨子鹤 常智 李全 牟甜甜 李翔 张晓丽

急性心肌梗死(acute myocardial Infarction，AMI)是心血管疾病中致死率最高的疾病之一，早期急诊溶栓和经皮冠状动脉腔内成形术仍是目前治疗MI最有效的临床手段[1］。然而对缺血心肌的再灌注通常会导致心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2］，采取积极手段避免MIRI的发生和发展，可明显改善AMI患者的左心室功能，最终改善患者的远期预后[3-4］。二甲双胍(metformin，MF)是常见的降血糖药，对缺血心肌的保护作用受到广泛的关注，其相关机制尚不明确。核医学分子影像学技术从分子水平，动态、在体实时评价MIRI心肌的血流灌注、心肌细胞代谢和细胞活性等一系列病理生理学特点，辅以组织病理学检测，深入探讨MIRI的发生发展过程，为此，本研究采用18F-FDG PET/CT心肌代谢显像，从分子影像学角度探讨MF干预对大鼠MIRI的作用及其潜在的价值。

资料与方法

1.实验动物 选用雄性，SD大鼠，16只，周龄约4～6周，体质量约200～240g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供。主要设备包括Inveon型Micro-PET/CT扫描仪(德国 SIMENS公司)、Matrx VMR型麻醉机(美国MATRX公司)、LeicaRM2235切片机(北京中仪光科科技发展有限公司)、免疫组化显微镜成像系统(ECLIPSE50i/55i，NICON)。显像剂18F-FDG由北京原子高科股份有限公司提供提供，放化纯＞95%。

2.方法 (1)MIRI模型制备：腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，麻醉成功后行气管插管，机械通气，而后开胸，于左侧第3肋间切口，在左心耳下缘距肺动脉弓根部2mm处，冠状动脉前降支面置硅胶管与冠状动脉一起结扎，缺血持续30min后松开结扎线，建立缺血再灌注损伤模型。结扎成功标志：结扎下方心肌颜色变成灰白色。复灌成功标志：心肌颜色由灰白逐渐恢复正常。

(2)动物分组：选取缺血再灌注损伤建模成功的12只SD大鼠(建模死亡率约为25%)，随机分为MF干预组(n=6)及正常对照组(n=6)，其中MF干预组自建模成功后第1天开始给予50mg·kg-1·12h-1剂量MF灌胃，正常对照组给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。

3.图像采集、重建和分析 (1)分别于建模成功后第1天、第7天、第14天、第30天行18F-FDG micro PET/CT门控心肌代谢显像。每次显像前称重记录大鼠，利用异氟烷-氧气混合气体(1.5%)行吸入式麻醉，之后尾静脉注射18F-FDG约37 MBq，注射30min后行micro PET/CT门控心肌代谢显像，PET扫描参数为：层厚 0.78mm，矩阵 128mm×128mm，采集时间20min，采集能窗350～650 keV。CT扫描参数：电压80kV，电流500A，层厚0.1mm，采集时间10min。扫描结束后，将扫描的图像用OSEM3D迭代重建(迭代4次，子集数为8)。

(2)重建后利用西门子自带图像处理软件Inveon Research Workplace勾画感兴趣容积(volume of interest，VOI)。分别大鼠心肌心尖部、心尖部周边、下后壁不同部位手动勾画VOI，分别代表缺血中心区、缺血边缘区和远端区，计算不同部位18F-FDG的标准摄取最大值(SUVmax)，SUV=局部感兴趣区放射性活度(MBq/mL)/注射放射性活度(MBq)/体质量(g)。计算中心区/远端区 SUVmax比值(TBR值)。勾画左心室心腔容积，获得左心室整体功能参数，包括舒张末期容积(EDV，mm3)，收缩末期容积(ESV，mm3)和 LVEF(%)。

4.组织病理学分析 于第30d图像采集后，处死大鼠，用手术剪沿腹中线剪开腹腔，取出心脏，用0.9%氯化钠溶液冲洗，滤纸吸干水分，沿冠状沟剪去心房，再沿室间隔剪去室间隔和右心室，获取左心室心肌。以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后，以5μm厚度连续切片，每隔5张取一张，用于HE染色，HE染色采用常规方法进行。

表1 两组不同时间点SUVmax值及左心室功能参数值(¯±s)

表1 两组不同时间点SUVmax值及左心室功能参数值(¯±s)

注：TBR两组比较，*P=0.010；EDV两组比较，**P=0.017

项目 第1天 第7天 第14天 第30天 F值 P值干预组中心区/远端区 0.83±0.16 0.85±0.05 0.82±0.13 0.81±0.06* 0.133 0.938 ESV/mm3 88.10±15.6 60.10±44.3 92.70±36.5 68.0±8.5 2.274 0.132 EDV/mm3 302.00±70.2 274.60±65.6 387.70±74.6 358.2±22.6** 4.272 0.029 LVEF/% 70.80±2.2 79.60±3.4 76.22±3.12 81.0±1.4 0.719 0.560对照组中心区/远端区 0.90±0.18 0.88±0.14 0.81±0.17 0.65±0.09 4.637 0.037 ESV/mm3 80.50±2.2 68.20±24.6 99.10±30.4 75.4±6.2 19.547 0.000 EDV/mm3 252.10±19.8 315.90±26.6 368.70±46.7 457.5±30.0 8.500 0.003 LVEF/% 67.90±2.3 78.40±2.5 73.10±3.0 83.6±1.1 0.251 0.859

图1 TBR值与EDV相关性分析结果 A：MF干预组，B：正常对照组

5.统计学方法 统计学处理采用SPSS 18.0软件。计量资料以均数±标准差表示，不同时间点比较采用单因素ANOVA分析，两组比较采用独立样本t检验。TBR值与心功能参数之间的关系采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.18 F-FDG microPET/CT门控心肌灌注显像定量分析 在第1天、7天、14天、30天不同时间点，MF干预组及正常对照组大鼠的心肌不同部位SUV-max值、中心区/远端区SUVmax比值(TBR值)及左心室功能参数如表1所示。

在MF干预组中，中心区与远端区SUVmax比值在各时间点无明显变化趋势，与EDV无明显相关关系(r=-0.218，P＞0.05)；而在对照组中，中心区与远端区SUVmax比值从再灌注后第1天至第30天逐渐减低，LVEDV逐渐增大，两者呈负相关关系(r=-0.732，P=0.000，图 1)。

在缺血再灌注术后1 d，7d和14d，中心区与远端区TBR值和LVEDV，MF干预组和对照组之间差异无统计学意义，而在治疗30d后，中心区与远端区的TBR值，MF干预组较对照组明显升高[(0.81±0.06)vs.(0.65±0.09)，P＜0.05］，差异有统计学意义。MF干预组LVEDV较对照组明显减小[(358.21±22.62)vs.(457.53±49.91)mm3，P＜0.05］，差异有统计学意义(图2)，提示MF干预治疗1个月后，MF减慢了左心室扩大及缺血再灌注损伤的程度；在再灌注术后不同时间点的左心室LVESV和LVEF，两组大鼠间比较，差异均无统计学意义。

图2 建模术后第30天，中心区与远端区的TBR值和LVEDV 注：两组比较，P＜0.05

2.组织病理学结果 两组大鼠缺血中心区组织切片HE染色镜下均见心肌细胞出现肿胀，胞浆呈颗粒状凝集而分布不均匀，呈嗜酸性，横纹模糊不清或者消失，其中正常对照组心肌细胞受损程度较MF干预组明显；两组大鼠缺血中心区组织切片均示正常心肌组织(图3)。

图3 两组大鼠心肌不同部位(中心区×10、远端区×20，HE染色比较)

讨 论

MF是临床上应用最早、最广泛和安全有效的双胍类降血糖口服药，众多的临床及基础研究发现其对心血管系统具有保护作用，可降低心血管事件和心力衰竭的发生率[5-6］。针对MF的研究，最近一篇Meta分析包括27项体外(心肌组织和心脏)和在体研究(动物实验和人体临床试验)，发现MF治疗可以减小心肌缺血和心肌梗死面积，减轻心室重构程度(收缩及舒张末期容积)，改善心功能，提高LVEF[7-8］。 因此，MF作为一个安全、有效和相对便宜的药物，在治疗糖尿病心力衰竭中的地位被得到广泛认可，并于2014年被美国糖尿病协会临床指南列为糖尿病合并心力衰竭患者的首选药物[9］。

目前大多数研究认为MF可通过多种途径保护心肌细胞，从而阻止和延缓心室重构和心力衰竭的发生和发展[10］。既往研究报道多采用小鼠、大鼠等MIRI在体和离体模型，评价MF对心血管的保护作用。然而，研究仅在治疗终点针对心肌组织进行病理、免疫组化等方法评价MF疗效，缺乏系统、连续的活体影像学研究。

本研究通过对大鼠急性灌注模型给予MF干预治疗，分别在建模后急性期(1d，7d)，亚急性期(14d)，慢性期(30d)行18F-FDG microPET/CT门控心肌代谢显像，动态评了MF治疗过程中，不同部位(缺血中心区、周边区和远端区)心肌代谢情况(SUVmax值)随时间动态变化的规律。在正常对照组中，中心区与远端区TBR比值从再灌注后第1天至第30天逐渐减低，LVEDV逐渐增大，提示无MF干预，MIRI程度随时间延长逐渐加重，左心室重构程度不断增加；而MF干预组中心区与远端区TBR比值未随时间延长而减低，EDV无明显变化，提示MF延缓了缺血再灌注损伤程度和心室重构的速度。在建模术后30d，我们发现MF干预组的缺血中心区与远端区TBR比值较对照组明显升高，MF干预组LVEDV较对照组明显减小，提示MF干预治疗一个月不仅对大鼠MIRI中的心肌有保护作用，而且延缓了心室重构。但是对于LVEF没有明显影响。可能原因，再灌注治疗后时间尚短，缺血再灌注损伤尚没有导致严重的整体收缩功能受损。

综上所述，18F-FDG microPET/CT显像，可以动态评估大鼠MIRI随时间变化的规律，MF干预对缺血再灌注损伤后大鼠心肌缺血具有一定的保护作用，减轻心肌缺血受损的程度，从而一定程度上延缓心室重构的发生和发展。