基于iTRAQ技术探讨心肌梗死小鼠重构期蛋白表达特点

王媛 尤宏钊 任璐 马友才 王绿娅 王雪 杜杰

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心血管病中危重的急性事件，近年来发病率有上升趋势[1］。大量研究证明，急性心肌梗死会导致心室结构和生物力学改变，包括心肌细胞凋亡、胶原沉积、肥大等，这些改变的机制尚未明确[2］。动物模型在研究急性心肌梗死中起到桥梁作用。研究发现，小鼠心肌梗死建模后14d所在分期对应急性心肌梗死后重构期，并且认为重构期在急性心肌梗死后的心脏修复中起到重要作用[3］。但是，既往研究较多关注在急性心肌梗死早期病理变化情况，而对心肌梗死损伤重构期分子表达水平，特别是是重构期心脏组织的蛋白质组学研究甚少[4］。准确描述急性心肌梗死后重构期蛋白谱的变化，不仅对探究病理生理学过程尤为重要，还可为筛选潜在的药物治疗靶点提供分子学信息。蛋白质组学(proteomics)是研究某类组织中所有蛋白质组成和功能的科学。传统蛋白质组学通常用双向凝胶电泳图谱分析(2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2DPAGE)技术进行研究[5］，这种方法鉴定的蛋白质数量有限且不能精确定量，介于上述缺陷，我们采用新近报道的同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术[6］，本技术优点在于吞吐量高，稳定性高，不受样本属性限制[7］。研究应用iTRAQ技术对急性心肌梗死重构期心脏组织蛋白进行定量分析，在结合生物信息学的基础上，分析差异蛋白所涉及的生物学进程，并探讨涉及的信号通路。

材料与方法

1.动物选择及分组 健康雄性，C57小鼠，18只，体质量18～20g，由北京安贞医院动物实验中心提供。所有小鼠术前禁食6h。本实验利用随机数字表法将18只小鼠分为两组(n=9)：分别为对照组(Sham组)，心肌梗死组(MI 14d组)。

2.材料及试剂 Q-Exactive质谱仪购自Thermo Finnigan(美国)。安捷伦常规液相，戴安纳升液相，布鲁克Ultraflex，蛋白浓度测定试剂盒购自 ThermoFisher(美国)。胰蛋白酶、SiTRAQ-plex标记试剂盒及缓冲液购自Applied Biosystems(美国)。

3.方法 (1)心肌梗死动物模型制备过程如本研究室前文所述[8］。将各组小鼠放入气体麻醉机chamber中麻醉后固定在鼠板上，迅速打开左前胸暴露心脏，用6-0proline丝线结扎冠脉，进针深度约1mm，观察左心室前壁颜色由鲜红变暗紫至苍白色，快速将心脏推入胸腔。挤出胸内气体，迅速缝合关胸。SHAM组穿线不结扎动脉，余步骤同MI组。两组术后均给予正常饲料饮水，两组小鼠术后14d后处死并检测蛋白表达水平。(2)小鼠心脏组织制备：各组取3只小鼠，MI组取小鼠左心室结扎线以下组织，Sham组正常摘取心脏，用液氮迅速冰冻并放入-80℃冰箱保存。(3)酶解及肽段定量标记：各取200μg样品分别加入DTT至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温，加200μL UA buffer(8M Urea，150mM TrisHCl pH8.0)混匀，转入 10kd超滤离心管，之后进行梯度离心。各组样品肽段分别去约100μg，按照 AB公司试剂盒：iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)说明书进行标记。

4.质谱分析 质谱分析原始数据用软件Proteome Discoverer 1.3进行查库鉴定及定量分析，采集的质谱数据用(Proteome Discoverer 1.3，Thermo Fisher Scientific)进行分析，数据库为Swissprot_mus库，采用mascot进行检索，检索的肽段和谱图匹配(PSM)，q值＜1%(1%的FDR)。检索后的肽段利用严格的最大简约原则合并成蛋白。

5.生物信息学分析分析 结果如本研究室前文所述[9］。为了降低物种间蛋白质异质性，所有差异蛋白首先利用Uniprot比对了人和小鼠中表达量的差异(www.uniprot.org)，使用AgriGO进行gene ontology(GO)注释和富集分析。GO项目描述了蛋白质在三个领域中的作用：生物过程，细胞成分和分子功能。在注释和注解增加之后，在“Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”(KEGG，http：//www.genome.p/kegg/)中依次将酶映射到注释序列和代谢途径[10］。

6.统计学方法 采用SPSS 21.0软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验或采用秩和检验。计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.蛋白质的鉴定和定量结果 基于iTRAQ的定量蛋白质组学，本研究解释了心肌梗死过程中心肌重构期差异表达的蛋白。利用质谱技术，共鉴定了10 324种独特的肽，对应1 551种蛋白质。

2.重构期心肌梗死蛋白表达谱 为了筛选与正常对照组有差异的蛋白，我们定义两组之间差异倍数＞1.2，或0.8，P＜0.05为差异蛋白，并且同时应满足所选肽链＞1、置信区间＞95%[11］。在鉴定到的蛋白中，MI组/SHAM组共有383个蛋白上调，有309个蛋白下调。进一步取差异蛋白的交集，我们绘制了上下调蛋白中前20的显著差异表达谱(图1)。

图1 前20上下调蛋白显著差异表达谱

3.差异蛋白的生物信息学分析和信号通路 为研究差异蛋白的总体趋势和功能学分类，我们用Gene Ontology(GO)对不同组别的差异表达蛋白共计692个进行了富集分析。差异蛋白的GO分析由生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)三个部分组成。主要结果分别呈现在图2～3中。

在生物过程中，MI组与Sham组相比，差异表达蛋白中上调蛋白主要涉及到通路集中在补体和凝血级联反应、免疫调控和炎症反应上(图2 A)，差异表达蛋白中下调蛋白主要涉及葡萄糖代谢、己糖分解代谢及氧化还原反应(图3A)。在细胞成分上，上调差异蛋白主要集中在细胞外区域及细胞内无膜结构，下调差异蛋白主要集中在线粒体和肌凝蛋白复合体等细胞成分(图2 B、图3 B)。在分子功能上，两组之间的差异表达蛋白主要涉及在肌动蛋白结合、细胞骨架连接、轴因子结合和运动活性上。

4.差异蛋白所涉及的信号通路研究 为探究所涉及的信号通路，我们采用KEGG分析鉴定了差异蛋白，心肌梗死后14d的心脏组织的蛋白表达主要涉及的信号通路是免疫反应和糖代谢通路。

讨 论

急性心肌梗死起病急，恢复慢且病死率高。在减少心肌坏死的基础上对心肌梗死后的心脏进修复可有效改善预后，提高生存质量[11］。重构期作为心肌梗死后心脏重构的关键时期，了解蛋白变化及机制对疾病的干预治疗有重要意义[12］。目前有关MI研究主要集中在急性期蛋白表达情况，对于心肌重构期蛋白谱的变化研究相对较少。为了探究重构期所涉及的蛋白变化，我们运用iTRAQ技术首次定量检测心肌梗死重构期差异表达的蛋白，结合生物信息学和公共数据库，描绘差异蛋白谱，发现其中主要涉及的病理过程是免疫反应和糖类代谢。

图2 急性心肌梗死重构期差异表达上调的蛋白生物信息学分析 A：SHAM/MI 14天组上调蛋白生物进程分析；B：SHAM/MI 14天组上调蛋白细胞成分预测；C：SHAM/MI 14天组上调蛋白分子功能预测；D：SHAM/MI 14天组上调蛋白信号通路分析

图3 急性心肌梗死重构期差异表达上调的蛋白生物信息学分析 A：SHAM/MI 14天组下调蛋白生物进程分析；B：SHAM/MI 14天组下调蛋白细胞成分预测；C：SHAM/MI 14天组下调蛋白分子功能预测；D：SHAM/MI 14天组下调蛋白信号通路分析

早期研究发现，在大鼠心肌梗死模型中，心肌损伤可激活补体级联反应，富含线粒体的亚细胞成分释放触发级联早期作用成分C1～C4的释出[13-14］。补体系统在活化过程中产生具有生物活性的蛋白片段，在中期持续升高会影响心肌梗死的恢复[12］。C4d、Bb分别是补体的经典和替代激活途径的产物。本项研究中发现心肌梗死重构期补体C5的水平显著升高，这与既往研究结果一致。C5b-9组成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，具有溶细胞作用[15］，在AMI患者血浆中MAC升高导致死亡率和心血管事件发生率升高[16］。既往动物研究中发现，利用抗-C5补体Pexelizumab辅助治疗可减少急性心肌梗塞后再灌注损伤，并在II期临床研究中证实了在急性冠脉综合征患者中获益[17］。此外，国内外的研究中也表明采用补体抑制剂抑制补体系统，可有效减轻心肌的缺血性损伤，缩小梗死面积。其次，缺血心肌细胞在调节因子的作用下产生炎症反应[18］。大量实验表明热休克蛋白、ATP、线粒体在心肌受损后刺激炎症级联反应，这些危险信号通过刺激Toll样受体家族成员发挥抗炎作用[19］。细胞基质蛋白凝血酶敏感蛋白(TSP)-1作为缩血管蛋白，在缺血过程中从内皮和心肌细胞中释放，促进血小板在动脉粥样硬化病变的内皮下层粘附聚集，在心肌缺血过程中，TSP-1通过激活CD47和CD36破坏NO信号通路和VEGF信号通路，干扰局部微循环，最终导致梗死后的过度纤维化。研究表明，TSP-1在心肌梗死后恢复有抑制作用[20］。

蛋白和糖代谢正常心脏可以利用多种底物产生能量，如脂肪酸、酮体、葡萄糖等[21］。心肌缺血时，心肌供氧不足，抑制脂肪酸的有氧氧化，无氧糖酵解增加，此时葡萄糖成为心肌主要能量来源[22］。有研究发现：能量代谢障碍发生后心肌细胞的基因结构及表达均受到影响，且心肌细胞内ATP水平与其凋亡坏死密切相关[23］。在心肌细胞中，线粒体作为最复杂的细胞器之一，承担有众多细胞功能包括脂肪酸代谢、能量产生和糖代谢等，前人研究证明在MI中心肌细胞线粒体活性与正常心肌相比下降严重[24］，这也从侧面印证了我们的研究结果。更为重要的是，既往研究发现及时纠正代谢异常可以有效地减少MI范围，我们的研究为进一步揭示了糖代谢在心肌梗死重构期的作用机制及寻找潜在的干预靶点提供了组学数据。

本研究首次利用相对定量的方法，探究了与正常心脏相比，心肌梗死14d后小鼠心脏组织蛋白表达的差异，并结合生物信息学，对差异蛋白进行了GO分析和通路分析，为探究蛋白表达水平在急性MI重构期的变化以及寻找潜在治疗靶点提供了结果支持。研究仍存在局限，iTRAQ实验在蛋白定量过程中并不是鉴定到的所有肽段均参与蛋白定量过程，可能在筛选过程中会出现遗漏情况；虽然在公共数据库中比对了人和鼠间差异，但仍做不到全部排除不同物种间异质性。

综上所述，定量蛋白质组学技术可用于组织蛋白鉴定和相对定量，利于更全面的了解蛋白与MI重构期的病理变化关系。本项研究的结果为探究急性MI重构期心脏组织蛋白所涉及的病理过程和潜在的治疗靶点提供了新的观点和证据。