盐酸克伦特罗多克隆抗体和量子点的偶联

金艳丹 ， 栗 慧 ， 张岩蔚 ， 魏 东

(1.河北省农产品安全检测重点实验室 ， 河北 张家口 075000 ； 2.河北北方学院食品安全研究中心 ， 河北 张家口 075000)

盐酸克伦特罗又称“瘦肉精”(CL)，是白色或类白色晶体粉状，无嗅、味微苦，化学性质较为稳定，属于苯乙醇胺类β2肾上腺类神经兴奋剂。它有较强的药性，化学性质稳定，溶解代谢率低，不易排出，残留量较高，大量用在饲料中可增强脂肪分解，肉迅速增长，大大提高了瘦肉率，增加瘦肉产量，虽说农药、饲料添加剂、动物激素等在一定剂量范围内使用，可以为畜牧业和经济的发展起一定的促进作用，但当其在生物体内含量超过临床用量的5～10倍时，便会导致畜禽中毒和大量药物残留，带来了相应的安全隐患[1]。研究表明，过多食用含有瘦肉精的肉制品对人体某些机能损害极大，易使人出现肌肉震颤、心悸、呕吐等症状，特别是对高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可导致死亡[2]。因此，研究一种高效、快速、简捷的检测盐酸克伦特罗类兴奋剂药物残留的方法是目前关键任务。

目前, 已经有多种技术可以对盐酸克伦特罗瘦肉精残留进行较为灵敏的检测。主要有高效液相色谱[3]、微生物法[4]、酶联免疫吸附法[5]、胶体金免疫法[6]等，其中高效液相色谱法已成为多个国家主要的检测方式，但该方法前处理比较复杂，所需仪器昂贵，难以普及。微生物法检测线过高，灵敏度低，特异性差，适合于初级的筛选也无法广泛适用。酶联免疫吸附法目前虽备受关注但也存在费时、费力等缺点，无法实现现场快速检测[7]。胶体金层析法虽比其他方法更适用但对于残留量较低的半抗原抗体物质仍旧很难进行定量分析，且很不能用肉眼观察，极大地限制了他的应用[8]。而近年来新兴的半导体纳米荧光材料量子点逐渐被人们开发作为荧光材料标记抗体，与传统的有机染料相比激发光谱宽，颜色可调，稳定性好，荧光强度高[9]。与胶体金相比量子点能检测出含量较低的抗原抗体，灵敏度更高，更适用于药物残留的基层检验和大量样品直接现场检测[10]。在免疫层析技术中，量子点与大分子物质偶联是建立荧光免疫层析法的基础，因此本试验主要以盐酸克伦特罗为研究对象，针对量子点的荧光性和抗体的生物功能，采用EDC/NHS偶联剂将二者共价偶联到一起，并经紫外扫描法、荧光扫描、斑点法及免疫法对二者偶联效果进行了鉴定，为新型免疫层析法和多残留检测试剂盒的研制打下了坚实的基础。

1 材料

1.1 试剂 盐酸克伦特罗、碳亚二胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG，Sigma 公司生产；羊血清、盐酸克伦特罗完全抗原、盐酸克伦特罗多克隆抗体，河北北方学院实验室自制；水溶性羧基量子点，北京北达聚邦量子点有限公司生产；TMB单组份显色液，北京索莱宝科技有限公司生产；其他试剂均为分析纯由国药集团有限公司生产，本次试验所用水均为超纯水。

1.2 仪器 手持移液器(Research Plus系列)，艾本德国际贸易有限公司生产；电子精密天平(JJ323BC)常熟市双杰测试仪器厂生产；台式高速离心机(TGL-16A)，金坛市仪都仪器有限公司生产；紫外分光光度计(Lambda 365)，韩国生产；荧光分光光度计(F-7 000)，日本岛津生产；微孔板恒温孵育箱(ST70-2)，深圳市优米仪器设备有限公司生产；恒温鼓风干燥箱(FX101-3)，上海树立仪器仪表有限公司生产；NC膜(0.8 μmol/L)，上海金标生物科技有限公司生产；酶标仪(Multiskan Mk3型)，赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

2 方法

2.1 量子点和盐酸克伦特罗抗体偶联 用注射器取600 μL水溶性羧基量子点溶液(2.5 μmol/L)加入1 mL的PBS(磷酸盐缓冲液)(pH值=7.0) 搅拌均匀，边搅拌边加入300 μL EDC(6 mg/L),将量子点活化20 min后加入100 μL NHS(6 mg/L)，继续28 ℃下搅拌20 min，最后加入750 μL盐酸克伦特罗多克隆抗体溶液，于28 ℃反应2.5 h。反应结束后将偶联物用超滤离心管在12 000 r/min条件下离心3 min，将样品反复浓缩纯化5次，每次浓缩比不小于10，最后置于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中于4 ℃避光保存。

2.2 偶联效果的检测

2.2.1 紫外分光光度计分析 将量子点和量子点标记抗体偶联物用PBS(pH值=7.0)稀释到一定浓度，在波长为400～700 nm范围内用UV3 900紫外扫描仪分别进行扫描，观察量子点和量子点抗体偶联物之间吸光度以及吸收光谱的变化。

2.2.2 荧光分光光度计分析 将量子点和量子点标记抗体偶联物用PBS(pH值=7.0)稀释到一定浓度，激发波长为540 nm，狭缝为10 nm，发射波长在400～700 nm范围内分别用荧光分光光度计扫描仪分别进行扫描，测定荧光强度，观察两者之间的变化。

2.2.3 斑点印迹法 将6 mg/mL CL-OVA点在NC膜上，干燥后用含3% 羊血清的PBS(pH值=7.0)封闭膜上未反应的蛋白结合位点，放置37 ℃恒温孵育箱中孵育1h，取出，用PBS或PBST反复洗涤膜。用相同方法制备2个印迹膜，干燥后依次滴加QDS-CL和QDS，于 37 ℃ 孵育器中反应25 min，用PBS(pH值=7.0)反复冲洗干净，用365 nm紫外灯观察图像。

2.2.4 荧光免疫学法 根据间接荧光免疫分析法测定已标记水溶性羧基量子点的盐酸克伦特罗多克隆抗体效价，具体步骤如下：包被、封闭、荧光抗体、二抗、显色、终止、最后在450 nm下测OD值。

3 结果

3.1 紫外光谱图 图1为量子点与盐酸克伦特罗抗体偶联前后的吸收光谱图。由图可知，量子点具有较宽的紫外吸收峰，而抗体标记后的量子点的紫外吸收峰变得更宽，原因可能是由于量子点标记上了抗体后，分子结构及数量可能发生了改变，使得吸收峰变得更宽。偶联后吸光度也有所增加，原因可能是量子点和抗体在EDC、NHS共价偶联作用下，形成了酰胺键，并且形成了核壳结构，降低了量子点表面核电荷数的减少，消除了一部分非辐射驰豫途径从而使吸光度增大。

3.2 荧光光谱图 图2为图2量子点与盐酸克伦特罗抗体偶联前后的荧光光谱图。由图可知，用抗体标记后的量子点，荧光吸收峰仍然很窄，最大吸收峰从560 nm到560.1 nm，荧光强度由652.3 nm增加到726.4 nm,略有增强。原因可能是由于量子点均匀的标记上了盐酸克伦特罗多克隆抗体，偶联物粒径变大，导致了荧光红移现象。并且抗体包覆量子点后，其表面产生了一定的钝化作用，降低了无辐射跃迁的几率量子点偶联物荧光强度增强。

图1 量子点与盐酸克伦特罗抗体偶联前后的吸收光谱

图2 盐酸克伦特罗沙丁胺醇抗体偶联前后的荧光光谱

3.3 斑点法 将制备好的NC膜放在三用紫外分析仪中观察，结果见图3所示，左膜在滴加CL-BSA 处有明显的橙黄色亮斑，右膜在 CL-BSA 滴加处没有出现橙黄色亮斑，结果表明，所制得的量子点与盐酸克伦特罗多克隆抗体偶联后，抗体并没有丧失识别抗原的特异性能力，呈现橙黄色亮斑。而膜2由于NC膜上由于没有抗体不能和抗原结合而被洗涤液洗掉，不显示亮斑，有点残留印迹。

图3 量子点和盐酸克伦特罗抗体偶联前后的斑点

3.4 免疫学方法 用水溶性羧基量子点和盐酸克伦特罗多克隆抗体偶联物进行间接荧光免疫法所得抗血清效价略有降低但仍可达32 000以上(P/N>2.1且P-N>0.2)，同时OD450值也呈良好的线性关系。因此说明量子点已经成功标在了盐酸克伦特罗多克隆抗体上且多克隆抗体的生物活性没有受到很大的影响，可为下一步试验提供参考依据。

4 讨论

4.1 荧光材料的选择 目前常用的荧光染料有荧光素类、罗丹明类染料、量子点。荧光素的虽然稳定性好，量子产率高，但荧光素的斯托克斯位移较小，对样品的发射光比较敏感。罗丹明类染料样品背景干扰小但荧光产率小，而近年来新兴的半导体荧光纳米材料量子点不仅具有激发光谱宽、发射光谱窄、稳定性强、荧光产率高、肉眼易观察等特性，还容易与蛋白质共价偶联，偶联物稳定性较强更适合长时间对半抗原样品进行定量分析。因此本试验选择量子点代替传统的有机染料作为荧光染料标记抗体。

4.2 偶联方法的选择 常见的偶联方法有静电吸引法、生物素-亲和素法、双功能连接试剂法。静电吸引法是通过正负电荷的吸引作用将两个物质连接起来，该方法需要试剂种类少、操作方法简单，而且偶联效果也良好，多用于分子生物学，但需要用到重组技术仪器设备比较昂贵，且对外部环境较敏感不利于大范围内推广使用。生物素-亲和素法放大了生物素和亲和素的共同效应，可用于抗原抗体的定量分析，方便快速但其内源性生物素的活性不易消除，容易影响结果。双功能连接试剂法是采用一种具有2个或2个以上特殊基团的反应末端的双功能偶联剂将蛋白和小分子或者荧光材料连接到一起的方法。常用的交联剂有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸硫磺基琥珀酰亚胺脂钠(sulfo-SMCC)。由于EDC具有很好的活化功能，NHS会增加基团活化，但会轻微导致荧光淬灭。因此，本试验采用EDC先将量子点上的羧基活化再加入少量NHS，这样不仅是量子点和抗体更好的结合，也不会因为NHS过量导致荧光淬灭，形成较为稳定的量子点和抗体偶联物

4.3 偶联物鉴定方法的选择 量子点和多克隆抗体偶联物鉴定的方法有紫外扫描法、荧光扫描法、斑点印迹法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、免疫学方法等等，紫外扫描法是指通过根据在一定波长范围内扫描的紫外吸收光谱来分析量子点及其量子点多克隆抗体的偶联物的情况，一般来说量子点抗体偶联物由于连上了抗体分子量一定会有所增加，其吸收光谱也会发生一定的变化，因此，来初步判断量子点是否成功标记在了量子点上；荧光扫描法是量子点及其偶联物在同一激发波长下使量子点及其偶联物在一定范围内发射一定的波长后波峰会发生一定的改变，荧光强度可能增加或降低来鉴定偶联效果；斑点印迹法实施根据抗原抗体反应原理，使荧光抗体和包被的抗原发生反应，在通过洗涤除去未反应的分子，最后通过观察颜色变化来进一步判断量子点抗体偶联物是否偶联成功；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法是依靠表面活性剂十二烷基硫酸钠(C12H25-OSO3Na)，将蛋白质的某些氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，去掉电荷效应最后根据迁移率得出分子量，鉴定抗体上是否偶联了量子点；琼脂糖凝胶电泳依据它自身产生的电荷效应和分子筛效应以琼脂糖作为电泳介质。根据不同电荷在电场中受力不同而产生不同的泳道把物质分开来鉴别是什么物质；免疫学方法是通过间接法来测定偶联抗体的效价，来分析量子点抗体偶联是否成功。因为电泳法操作时间长且过程繁琐到导致操作起来不方便且毒性大，所以本试验综合各方面考虑选择了紫外荧光扫描法、荧光扫描法、斑点印迹法、免疫学这4种方法来鉴定量子点是否成功标记在了盐酸克伦特罗多克隆抗体上。

5 结论

本试验通过EDC(碳亚二胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)偶联剂的活化作用将纯化后的CdTe/ZnS量子点和盐酸克伦特罗多克隆抗体共价偶联成荧光复合物，并经过紫外分光光度计分别扫描其最大吸收峰、荧光分光光度计扫描其发射峰和荧光强度、斑点法观察抗原抗体特异性结合现象鉴定了水溶性羧基量子点稳定的荧光特性，抗体的生物活性，证明了量子点成功标记了抗体，总之，本次研究结果可进行下一步试验，为多残留检测试剂盒和试纸条应用研究提供了重要的依据。

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