可视环介导恒温扩增技术检测实验猴小肠结肠炎耶尔森菌

温和心 ， 龙英全 ， 蒋荣华 ， 盘宝进 ， 罗广生 ， 陈立军

(1.贵港出入境检验检疫局 ， 广西 贵港 537100 ； 2.灵长类实验动物国家重点实验室 , 广西 南宁 530028；3.玉林出入境检验检疫局 ， 广西 玉林 530000)

小肠结肠炎耶尔森菌能致人和其他多种动物发生胃肠炎、关节炎、败血症及结节性红斑等病，是非常重要的人兽共患病病原。该细菌在我国的分布非常广，从人群、动物、外环境和食品都可以分离出病原菌[1]。该病与人们日常生活关系密切，流行病学研究表明，小肠结肠炎耶尔森菌能在冷藏温度下生长繁殖，故冰箱是耶尔森菌小肠结肠炎重要的传染源，俗称“冰箱菌”。本自治区是实验猴出口大省，国际一些进口国逐渐对猴小肠结肠炎耶尔森菌提出检疫要求。该细菌主要以分离培养方法进行检验，从低温增菌到确定细菌的血清型、生物型大约需要1周的时间，耗时较长[2]，无法满足检疫要求。可视环介导恒温扩增检测技术是在LAMP体系中加入指示剂，可以目测反应结果，既免除产物电泳步骤，又减少产物污染，克服LAMP技术易污染的缺点，更好地发挥LAMP技术的优势。 把可视LAMP技术应用于小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测，解决当前小肠结肠炎耶尔森菌检疫，意义重大。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 小肠结肠炎耶尔森菌CMCC5220，鼠疫耶尔森菌DNA(疫苗菌，凭祥出入境检验鼠疫国家重点实验室赠)，假结核耶尔森菌CMCC53504，大肠杆菌ATCC25922，伤寒沙门菌CMCC50039，痢疾志贺菌ATCC51252，空肠弯曲杆菌ATCC33291，溶血性链球菌CMCC32121，李斯特菌ATCC19111，粪肠球菌ATCC35667，金黄色葡萄球菌ATCC6538，表皮葡萄球菌ATCC12228，铜绿假单胞菌ATCC27853，产气荚膜梭菌ATCC13124，肺炎克雷伯菌CMCC46117，阪崎肠杆菌ATCC29544，奇异变形杆菌ATCC25933。

1.1.2 试剂与设备DNA大片段聚合酶试剂盒(Bst酶，Neb)，PCR试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)；脱氧核苷酸(dNTP，天根生化科技(北京)有限公司)；羟基萘酚蓝(HNB,Sigma公司)；甜菜碱(betaine,Sigma公司)；硫酸镁(AR,Sigma公司)；矿物油(Sigma公司)；引物、探针(Lifetect公司)；荧光PCR仪(ABI7500)，PCR仪(ABISimpliAmp公司)；水浴锅(上海—恒科技仪器有限公司，HWS24)；麦氏浊度仪(梅里埃(上海)生物制品有限公司，Densicheck)；紫外仪、电泳仪、电泳槽(北京六一仪器厂,WD-9403D、DDY-2C、DYCP-34)等。

1.1.3 小肠结肠炎耶尔森菌引物设计 引物序列信息见表1。

表1 小肠结肠炎耶尔森菌引物序列信息

1.2 方法

1.2.1 细菌浓度的标定和DNA的提取 从平皿中挑取小肠结肠炎耶尔森菌单个菌落，接种于3 mL的营养肉汤中，36 ℃培养过夜，8 000 r/min离心2 min，弃上清，沉淀用0.9%生理盐水洗涤、离心1次，沉淀物用去离子水悬浮，用麦氏浊度法标定细菌浓度， 即1MCF≈3×108CFU/mL[4]。取菌液隔水煮沸15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清即为细菌DNA，冷冻备用。

1.2.2 LAMP反应体系高温-低温前处理试验 设A和B 2个试验组，A组将未添加Bst酶的反应体系先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、开盖加入Bst酶并混匀，最后加入150 μL矿物油，密封管盖，63 ℃水浴1.5 h，直接目测观察结果。B组反应体系配制好后，直接63 ℃水浴1.5 h，目测观察结果。A、B 2个试验组同时检测小肠结肠炎耶尔森菌DNA各稀释度，比较两个试验组的灵敏度。

1.2.3 反应体系添加甜菜碱试验 设A和B 2个试验组，A组反应体系含有0.8 mol/L的浓度甜菜碱，B组反应体系不含甜菜碱，反应程序是反应体系(不含Bst酶)先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、开盖加入Bst酶并混匀，最后加入150 μL矿物油，密封管盖，63 ℃水浴1 h，直接目测观察结果。A、B 2个试验组同时检测Y.e菌DNA各稀释度，比较两个试验组的灵敏度。

1.2.4 PCR、荧光PCR、电泳LAMP、可视LAMP比较灵敏度试验 PCR和荧光PCR反应体系、反应程序均按试剂盒说明书进行。LAMP反应体系见表2。

表2 LAMP反应体系

LAMP反应体系前处理：反应体系(不含Bst酶)先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、开盖加入Bst酶并混匀，最后加入150 μL液体石腊，密封管盖。

LAMP反应程序：63 ℃水浴1 h，煮沸2 min终止反应，取4 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，拍照分析结果。可视LAMP反应体系即是在LAMP反应体系基础上加入2 mmol/L羟基萘酚蓝(HNB)1.8 μL, 反应体系前处理与反应程序与LAMP相同，不进行产物电泳，直接目测观察结果。上述4种方法检测小肠结肠炎耶尔森菌DNA 各稀释度，根据结果比较各方法的灵敏度。

1.2.5 可视LAMP特异性试验 将假结核耶尔森菌、大肠杆菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、空肠弯曲杆菌、溶血性链球菌、李斯特菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、产气夹膜梭菌、肺炎克雷伯菌、阪崎肠杆菌奇异变形杆菌13种常见的致病菌培养过夜，按1.2.1法将菌液稀释至1MCF后，采用热裂解法提取细菌DNA。用可视LAMP反应体系和反应程序，检测各细菌DNA，检验可视LAMP特异性。

1.2.6 样品基质干扰试验设置2种采样方式，取猴肛拭子、猴粪便2 g各1份置于10 mL增菌液中，36 ℃培养过夜，分别取上层增菌液3 mL备用。分别用增菌液按10倍递增法稀释1MCF浓度的小肠结肠炎耶尔森菌，将各个稀释度的菌液离心，沉淀用去离子水洗涤1遍，最后用去离子水恢复至原体积，使沉淀完全悬浮。按1.2.1法热裂解细菌提取DNA。用可视LAMP检测所提取的DNA，比较样品基质对试验的干扰情况。

1.2.7 可视LAMP与分离鉴定法比较试验 在实验猴繁育场分别采用可视LAMP方法和分离鉴定方法—实验动物耶尔森菌检测方法(GB/T 14926.3-2001)检测实验猴小肠结肠炎耶尔森菌，统计两种方法的检验结果，比较二者的检出率和符合率。

2 结果

2.1 LAMP反应体系高温-低温前处理试验结果

如中插彩版图1所示，反应体系经过高温-低温前处理的A组敏感性是6 CFU/反应，未经过高温-低温前处理的B组敏感性只有600 CFU/反应，A组敏感性显著高于B组，证明高温DNA变性-低温促使DNA与引物结合，可显著提高可视LAMP方法的敏感性。

2.2 反应体系添加甜菜碱试验结果 反应体系添加甜菜碱 A组敏感性是6 CFU/反应，未添加甜菜碱B组敏感性是60 CFU/反应，A组敏感性显著高于B组，A、B均无假阳性产生，证明明甜菜碱是有助于促进DNA变性，打开双链，创造引物与DNA结合的有利环境，所以反应体系中添加甜菜碱可显著提高可视LAMP方法的敏感性。

2.3 PCR、荧光定量PCR、传统LAMP、可视LAMP敏感性试验结果 如中插彩版图2-A显示小肠结肠炎耶尔森氏菌fox基因的PCR扩增产物电泳结果，产物长度在300 bp左右，与目标基因311 bp相符，PCR扩增产物量随模板量降低而减少，最低检出限为60 CFU/反应。如中插彩版图2-B显示小肠结肠炎耶尔森菌Yst基因荧光定量PCR扩增扩增曲线，最低检出限为6 CFU/反应。传统LAMP和可视LAMP都可以对小肠结肠炎耶尔森菌PHOP基因有效地扩增，中插彩版图2-C 显示，LAMP扩增产物琼脂糖凝胶电泳条带呈典型的梯状排列，最低检出限为6 CFU/反应。中插彩版图2-D结果显示可视LAMP，阴性管保持蓝紫色无变化，阳性管变成青蓝色，最低检出限为6 CFU/反应，证明指示剂羟基萘酚蓝对LAMP反应无不良作用。 综合以上结果表明，可视LAMP与荧光定量PCR、传统LAMP方法检测敏感性相当，都是6 CFU/反应，高于PCR法敏感性60 CFU/反应，可视LAMP目测判定结果，简单明了，技术优势明显。

2.4 可视LAMP特异性试验结果 中插彩版图3显示可视LAMP特异性试验结果，只有小肠结肠炎耶尔森菌呈阳性反应，同属的鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌呈阴性反应，大肠杆菌、粪肠球菌等肠道常见菌均呈阴性反应，表明该可视LAMP对小肠结肠炎耶尔森菌有较强的特异性。

2.5 样品干扰试验结果 样品干扰试验结果显示，肛拭子组、猴粪便干扰组可视LAMP敏感性均达到6 CFU/反应，无假阳性，表明肛拭子、猴粪便增菌培养物对可视LAMP的敏感度和特异无明显影响。

2.6 可视LAMP与分离鉴定法对比试验结果 应用可视LAMP和分离鉴定法同时检验实验猴肛拭子21批次共3 050头份，结果分别检出15份和9份阳性样品，分离鉴定法9份阳性样品包含于可视LAMP阳性样品中，表明可视LAMP检出率显著高于分离鉴定法。不仅如此，可视LAMP法检验效率高于细菌分离鉴定法，结果判定直观明了，可以显著提高猴场小肠结肠炎耶尔菌检疫技术水平。

3 结论

本研究的创新在于在环介导恒温扩增反应体系中引入指示剂形成可视LAMP，根据反应管颜色变化判断结果，减少了原有技术开盖凝胶电泳步骤

和由此造成气溶胶污染，使LAMP技术实用价值更高。本研究证明了对反应体系进行高温-低温变温前处理、在反应体系中添加甜菜碱等措施均可显著提高反应灵敏度。据此建立的可视LAMP检测小肠结肠炎耶尔森菌方法的灵敏度与传统LAMP相同，与荧光PCR相当，显著高于PCR。该方法与小肠结肠炎耶尔森菌呈特异性反应，与耶尔森菌属其他细菌和肠道常见菌呈阴性反应。反应受肛拭子或粪便样品基质干扰不显著。可见可视LAMP检测小肠结肠炎耶尔森菌操作方便快捷，结果灵敏准确，设备要求简单，特别适合基层或野外作业，是有推广应用价值检测技术。

参考文献:

[1] 陈邬锦,王鹏.中国小肠结肠炎耶尔森菌流行现状及其研究进展[J].中国人兽共患病学报,2015，31(4):380-384.

[2] GB/T 14926.3-2001, 实验动物耶尔森菌检测方法[S].

[3] Li Y, Jiang M, Liu W,etal. Loop-mediated isothermal amplification method targets to the phoP gene for detection of Yersinia enterocolitica[J]. Molecular & Cellular Probes,2009,24(2):68-71.

[4] 中国药典：二部[S]. 2010：附录 93-98.