猪细小病毒检测基因芯片的构建及初步应用

吴凤笋 ， 吕玉金 ， 刘玲玲 ， 赵 迪 ， 李文刚

(1.河南牧业经济学院动物医学院 ， 河南 郑州 450046 ； 2.河南农业大学牧医工程学院 ， 河南 郑州 450002)

猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种猪繁殖障碍性疾病，怀孕母猪发生流产，产死胎、木乃伊胎。该病在世界许多国家和地区都有不同程度的发生和流行，严重影响了养猪业的健康发展[1]。因此，建立一种敏感、快速、准确的猪细小病毒检测方法就尤为重要。

本研究将荧光标记的猪细小病毒VP2基因PCR扩增产物与固定于基因芯片上的探针进行杂交制作基因检测芯片，以达到能快速、准确的检测到猪细小病毒，为生产实践提供一种检出率高的诊断方法。

1 材料与方法

1.1 分离毒株 猪细小病毒分离毒株由河南农业大学魏占勇教授惠赠。

1.2 主要仪器及设备 基因芯片点样仪(美国Bio-Dot公司)；Innoscan700型基因芯片扫描仪(法国Innopsys公司)；PCR仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)；恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)； DYY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂)；Tanon 2500全自动数码凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)。

基因芯片点样液、杂交液、醛基基片、芯片杂交盒(博奥生物集团有限公司)；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)；5× 电泳储存液(5×TBE)、洗脱液1、2、3等均由河南牧业经济学院猪病防控中心实验室配制。

1.3 基因组DNA的提取 按照常规细胞培养方法，在PK-15细胞上增殖病毒，按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取猪细小病毒DNA模板。

1.4 引物及探针的设计与合成 参照文献，以猪细小病毒(GenBank序列号为：NC-001718)VP2蛋白的基因序列为靶序列，利用Primer Primer 5.0引物设计软件设计特异性引物和探针。

上游引物：5′-CAAACAGATCTCTAGGACTGC-3′；

下游引物：5′-Cy3-GTGGTTAAGTGTCCATGTTGG-3′；

探针：5′-NH2-TTTTTTTT-CAGCAATTAGGCCAGCTC-3′。

在下游5′端进行Cy3荧光标记，探针的5′端氨基化修饰，并在氨基和探针之间加上8个T。特异性引物和探针均在宝生物工程(大连)有限公司合成。用TE Buffer稀释成10 μmol/L的浓度，置于-20 ℃冻存备用。

1.5 基因芯片的制备 首先，使用TE Buffer将合成的PPV的冻干探针稀释成100 μmol/L的母液，最终稀释成5 μmol/L(5 μL探针+45 μL灭菌水+50 μL点样缓冲液)。然后，在96孔U形板的A孔加入100 μL点样缓冲液作阴性对照，B孔加入100 μL含荧光的PCR产物作阳性对照，C孔加入100 μL 5μmol/L的探针。最后，按照基因芯片点样仪预定程序对醛基基片进行喷点式点样。点样环境：相对湿度55%～65%，温度20 ℃～30 ℃；点样阵列：设定为六矩阵，每个矩阵内点样为5×3；探针固定：利用盛有探针固定增效剂的湿盒存放点样完毕的芯片，置于烘箱固定备用。芯片点样方式见图1。

图1 芯片点样阵列示意图A:阴性对照 ； B:阳性对照 ； C:浓度为5 μmol/L探针

1.6 杂交用PCR产物的制备与鉴定 杂交用产物选择不对称PCR，反应总体积为25 μL，其组成为：5×Buffer 5.0 μL、dNTP(10 mmoL/μL) 2.0 μL、上游引物(10 μmol/L)1.0 μL、下游引物(10 μmol/L)2.0 μL、模板DNA1.0μL、Prime STAR 0.3 μL、ddH2O 13.7 μL。除下游引物外其他成分充分混合后在暗室中加入下游引物，混匀后于PCR仪内扩增。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循环，72 ℃延伸5 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳并用凝胶成像分析系统观察拍照。

1.7 基因芯片的杂交 将PCR产物在PCR仪内98 ℃变性10 min，取出后立即冰浴5 min，取该变性产物和杂交缓冲液按1∶4(40 μL PCR产物与160 μL杂交缓冲液混合)的比例在离心管中混匀。将芯片放入杂交盒内，再将上述混合液体加到芯片的点样区，最后置于47 ℃恒温箱中进行避光杂交1 h。用50 ℃预热的洗液1、2、3对完成杂交的芯片在暗室内各洗涤2 min，离心干燥后扫描分析。

1.8 临床样品的检测 利用建立的基因芯片方法对20份临床样品进行检测，然后使用同样的特异性引物对样品中提取的DNA进行PCR扩增检测以及阳性样本的 PCR 产物DNA 测序进行验证，并将两者结果进行对比。

2 结果与分析

2.1 不对称PCR扩增结果与分析 以PPV基因组DNA为模板，与特异性引物进行不对称PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果见图2。由图2可见扩增片段与预期目的片段一致。

图2 不对称PCR电泳图

2.2 PPV基因芯片扫描结果与分析 将不对称PCR扩增产物与固定在芯片上的探针进行杂交，扫描杂交结果见图3.

图3 PPV检测芯片杂交扫描结果

2.3 临床样品检测结果 用建立的基因芯片检测方法与PCR方法同时应用于临床样品的检测，结果表明，两个结果的符合率达100%。其中20份样品中，猪细小病毒阳性样品为1份。这与猪场接种疫苗有关。

3 结论与讨论

3.1 基因芯片检测技术 对于猪病感染，传统的病原分离鉴定和血清学方法等对病毒性疫病的诊断存在操作复杂、费时费力、敏感性较差等不足，而基因芯片技术是集分子生物学技术、计算机技术以及标记于一体的基因分析技术[2]，该技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。

基因芯片技术自应用于病原的诊断后，其所具有的灵敏、特异及高通量特点弥补了其他检测方法的不足，可以通过建立基因芯片探针，在一个平台上、一次检测中对大量的样品进行病原诊断，利于对疾病作出快速、准确的诊断，适合大量临床病料中病原体的快速检测。且具有并行性，即在同一反应条件下，可有效地避免了误差，提高检测结果的可信度；自动化，利用计算机完成制备过程及获取结果，避免人工误判，结果更加客观准确[3,4]。

3.2 不对称PCR的应用 本研究采用不对称PCR扩增目的基因，因双链DNA与基因芯片探针结合，大部分为两条链之间的自身无效杂交，将影响到检测结果，而单链DNA更易与探针结合，其杂交效率要远远高于双链DNA，灵敏度也更好[4]。因此，芯片杂交时需获得足够量的单链DNA，而不对称PCR就是一个有效的途径。本试验利用不对称PCR方法来获取单链DNA，为了保证在杂交过程中有大量的核酸参与，通过控制上下游引物(下游引物进行荧光标记)的比例来保证单链DNA的获取量，试验结果表明，上下游引物的浓度采用1∶2的比例可以获得较好的杂交信号。

3.3 目的基因的标记和探针的修饰 本研究目的基因的标记采用PCR扩增标记，其优点是在完成对目的基因特异性扩增的同时也完成了对目的基因的荧光标记，提高检测的灵敏度[5]。芯片杂交是游离的靶序列与固定在玻片上的探针结合的过程，探针与玻片的距离过小会增大杂交时的空间位阻，会使靶序列与探针不易结合。因此，在探针的5′端加上8个PoLy(dT)，增加一定长度的间隔臂PoLy(dT)，减小空间位阻，利于芯片的杂交[6-7]。且在寡核苷酸芯片的制备过程中，可根据寡核苷酸探针的长短来选择功能化基片，一般来说，氨基化玻片或多聚赖氨酸(PLL)玻片适用于较长的探针(长度超过50 mer)，较短的寡核苷酸探针选择醛基化玻片。本试验中设计的探针长度为18 mer，所以选用醛基化玻片，在探针合成时5′均需要氨基化修饰，便于探针在醛基基片上的固定。

本研究制备的猪细小病毒检测基因芯片，可成功地检测到猪细小病毒VP2基因，且重复性强、稳定性好、敏感性高，其中敏感性可达34.5 ng/μL，比PCR检测的灵敏性更高，是一种简便、快速的诊断方法，在生产实践中有很高的应用价值[8]。

本研究通过对试验条件的反复摸索，采用浓度为5 μmol/L的探针与PCR产物杂交1 h即可得到清晰的荧光信号，采用较低浓度的探针降低了成本。本研究将基因芯片技术应用于动物疫病的检测，解决了疫病检测中的难题，具有一定的理论意义和应用价值[9]。该方法也为其他病原应用基因芯片方法检测提供了理论基础。

对于危害我国养猪业发展的疫病的快速诊断是控制该病的重要前提，而传统的生物学方法存在着费时费力、敏感性低、操作复杂等不足，而基因芯片有所具有的高特异性、高通量、高敏感性可弥补传统方法的不足，但是传统的芯片平台因依赖于荧光标记技术，需要昂贵的扫描设备进行扫描以及操作过程复杂，对技术要求较高，难以做到基层推广。因此，需要进一步降低生产成本，来促进诊断用基因芯片的商品化，实现在规模猪场常见传染病的鉴别诊断中的应用常态化。

参考文献：

[1] 吴凤笋，李文刚，樊淑华，等.表达猪细小病毒VP2基因重组伪狂犬病病毒转移载体的构建[J] .河南农业科学，2006，3(2)：102-104.

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[3] 吕梁,马文丽,石嵘, 等.细小病毒B19诊断芯片的初步研究[J].生命科学研究，2004，8(3)：260-263.

[4] 伍诚意, 曹峰子, 梁之昶, 等. 用于检测仔猪致病菌的23S rRNA基因芯片的研制[J] .中国兽医科学, 2010, 40 (3): 258-264.

[5] 张海燕, 马文丽, 李凌, 等. 应用不对称PCR技术提高寡核苷酸基因芯片杂交效率[J].军医进修学院学报, 2005, 26(4):266-268.

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[7] 刘玲玲，李文刚，唐桂芬，等.猪链球菌2型基因芯片检测技术的建立[J].河南农业科学，2013,10(2):128-131.

[8] 潘继红，韩金祥，黄海南，等.寡核普酸芯片探针固定化和杂交条件的优化[J].临床检验杂志，2003, 21(3):150-152.

[9] 吴凤笋，李文刚.基因芯片技术在动物疫病检测中的应用[J].郑州牧业工程高等专科学校学报，2011, 31,(2):22-23.

[10] 叶芬，蔡家利.基因芯片技术在猪病毒性疾病诊断中的应用[J].动物医学，2010,31(7):87-90.