香连溶液阻断猪流行性腹泻病毒感染的临床效力研究

常洪涛 ， 李永涛 ， 黄慧敏 ， 张 灵 ， 侯晓礁 ， 王秀敏 ， 王川庆 ， 刘慧敏

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002 ； 2.北京市中兽药工程技术研究中心 ， 北京 昌平 102206 ；3.河南农业大学生命科学学院 ， 河南 郑州 450002)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起猪的一种以水样腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要临床特征的肠道传染病[1]。1978年英国、比利时首次发现该病[2]，随后各主要养猪国家相继报道，国内于1984年证实存在,多年来一直严重影响我国养猪业的健康发展[3]。2010年11月至今，以PEDV为主要致病因素的新生仔猪急性腹泻疫情在全国范围内大暴发[4-5]，发病率和死亡率均高达90%以上，目前仍尚无有效的防控措施，抗生素治疗仅能防止继发感染[6]。已有研究表明，当前PEDV新流行毒株较疫苗毒株CV777相比已发生较大变异，使得现有商品化疫苗的免疫保护效果均不理想[7]，同时新流行毒株却又难以分离、驯化并加以应用。以消毒为核心的生物安全措施是防控动物传染病的最主要措施之一[8]，而选择理想的消毒剂至关重要。当前在养猪生产中应用最为普遍的是醛类、含碘类、过氧化物类和表面活性剂类等化学消毒剂，它们产生作用迅速，消毒谱广，对病原微生物的杀灭作用很强，但都不同程度地存在环境污染、药物残留、具有毒性和刺激性等副作用，并不能完全满足疫病防控中的消毒需要。与此同时一些以中药消毒剂为代表的新型环保消毒剂的研究逐渐展开和深入。香连溶液是一种纯天然植物消毒剂，由黄连、苦参、香薷和艾叶等多味中药提取、加工精制而成，具有杀灭病原、清新辟秽和解毒消疮的功效，可用于动物体、环境及饮水消毒。本研究拟选用香连溶液对PEDV传播途径的阻断效果进行探讨，以期为有效防控PED提供一种优质的消毒剂。

1 材料与方法

1.1 消毒剂、疫苗和试验动物 香连溶液由北京生泰尔科技股份有限公司提供；过硫酸氢钾三盐复合物消毒剂为江苏省某生物工程有限公司产品；猪传染性胃肠炎(TGE)-PED二联灭活疫苗由四川某生物制品厂提供。25头1～3日龄新生仔猪由西平县某种猪场提供，经检测PED抗体为阴性；135头临产母猪由鹤壁市某正在发生PED疫情的猪场提供；随机选择规模化猪场、中小型猪场和养猪专业户各3个，每个猪场选择20头待产母猪备用，在其发生PED疫情时开展试验。

1.2 病毒、细胞和检测相关试剂 PEDV YM13株由河南农业大学动物传染病实验室分离、鉴定并保存；Vero细胞、细胞培养和PEDV RT-PCR检测[9]的相关试剂均由河南农业大学动物传染病实验室提供；PED抗原快速检测卡，购自韩国BIONOTE公司。

1.3 试验方法

1.3.1 香连溶液对细胞安全浓度的测定 将香莲溶液用DMEM分别稀释成原液、2倍、5倍、20倍和50倍等5个稀释度，分别接入已铺满单层Vero细胞的细胞板，每个浓度做2个重复，作用30 min观察，同时设立空白对照。

1.3.2 香连溶液对PEDV增殖的抑制作用测定 将香连溶液用DMEM分别稀释成25倍、50倍、500倍和1 000倍后，与YM13株病毒培养液等剂量混匀，使其药物终浓度分别为50倍、100倍、1 000倍和2 000倍，室温作用30 min后，再接种Vero细胞，孵育1 h，3 d后观察并筛选最佳抑制浓度，同时设立空白对照。

1.3.3 香连溶液对PEDV感染仔猪的防治试验 将香连溶液作50倍稀释，YM13株病毒培养液作10-3稀释后备用。将25头1～3日龄健康仔猪随机分为5组，隔离饲养，具体试验操作见表1。

表1 仔猪分组及试验设计

1.3.4 香连溶液对PEDV传播途径的阻断试验 选择1个正在发生PED疫情的规模化猪场，筛选待产母猪100头，随机分为10组，每组10头，各组每日的乳头消毒次数分别为12、10、8、6、5、4、3、2、1次和0次。同时筛选10头设立为过硫酸氢钾三盐复合物对照组，消毒次数为6次/d。各试验组均于分娩后首日应用香连溶液进行乳头擦拭消毒，持续7 d，同时筛选最佳消毒次数，并于每次消毒30 min、60 min和120 min后，随机选择母猪乳头用细胞培养液冲洗，用于PEDV的分离和鉴定。再筛选待产母猪25头，隔离饲养，TGE-PED二联灭活疫苗均于产前40 d、20 d各免疫1次，分娩后再按筛选的最佳消毒次数进行乳头消毒，持续7 d，具体操作见表2。

表2 母猪分组及试验设计

1.3.5 香连溶液对PEDV传播途径阻断的临床推广 随机选择规模化猪场、中小型猪场和养猪专业户各3个，每个猪场选择20头待产母猪，隔离饲养，TGE-PED二联灭活疫苗均为产前40、20 d各免疫1次，在其发生PED疫情时开展试验。分娩后按筛选的最佳消毒次数使用香连溶液进行乳头消毒，共持续7 d，具体操作见表3。

表3 不同规模猪场的试验分组及试验设计

2 结果

2.1 香连溶液对Vero细胞安全浓度的测定结果 将不同稀释度的香连溶液分别与Vero细胞作用30 min后发现细胞在原液和2倍稀释时均皱缩、贴到底部，5倍稀释时整块漂落，20倍稀释时有零星变圆、漂起，50倍稀释时为正常状态，与空白对照组相比无明显区别(中插彩版图1)。

2.2 香连溶液抑制病毒作用测定结果 不同稀释度的香连溶液分别与YM13株作用后，经计算测定其蚀斑形成单位(PFU/mL)分别为8.4×104、1.96×105、5.36×105和6.0×105，对照组为6.44×105(中插彩版图2)，数据分析结果表明，50倍和100倍稀释时对病毒有明显的抑制作用，1 000倍稀释时抑制作用不明显，2 000倍稀释对病毒增殖基本没有影响，从而推断将香连溶液作50～100倍稀释时，可有效抑制PEDV的增殖。

2.3 香连溶液对PEDV感染仔猪的防治试验结果 3组试验猪分别于3 h、8 h和6 h时开始呕吐灰红色液体，均于24 h时发生水泻，分别于72 h、30 h和36 h时全部脱水、死亡；过硫酸氢钾三盐复合物组均于6 h时出现呕吐，12 h时发生腹泻和脱水，24 h时全部死亡；空白对照组均于6 h时出现呕吐、腹泻和严重脱水，24 h时全部死亡。所有试验猪经RT-PCR和PED抗原快速检测卡检测后，均为PEDV阳性(图3、中插彩版图4)，证实通过对初生仔猪灌服香连溶液和其他消毒剂的措施无法阻止PEDV感染和发病，但先灌服香连溶液组的病程有所延长。

图3 PEDV RT-PCR检测结果

2.4 传播途径阻断试验结果 试验母猪均于分娩后首日应用香连溶液进行乳头擦拭消毒试验，共持续7 d。结果表明，各组的发病率依次为25.0%、26.3%、28.3%、29.2%、48.7%、57.5%、61.8%、87.5%、93.2%和99.5%，过硫酸氢钾三盐复合物组的发病率为68.3%，表明每日使用香连溶液进行6次以上乳头消毒时，发病率均维持在30%以内，且差异不显著(P>0.05)，随着消毒次数逐步减少，发病率也随之大幅提高，因此，最佳消毒次数筛选为6次/d。各试验组于每次消毒30 min和60 min后，均未分离到PEDV(中插彩版图5)，消毒120 min后，均可分离到PEDV(中插彩版图6)，RT-PCR检测结果全部为阳性(图8)。过硫酸氢钾三盐复合物组于每次消毒30 min后均未分离到PEDV，60 min后均能分离到PEDV(中插彩版图7)，RT-PCR检测结果全部为阳性(图8)。免疫疫苗同时配合乳头消毒试验组的发病率最低，为2.8%，只免疫疫苗未进行乳头消毒试验组为11.4%，未免疫疫苗只进行乳头消毒试验组为29.1%，过硫酸氢钾三盐复合物和空白对照组分别为66.7%和97.3%。

2.5 临床推广结果 不同规模猪场的各组母猪均于分娩后首日使用香连溶液进行乳头擦拭消毒试验，持续7 d。结果表明，规模化猪场、中小型猪场与养猪专业户免疫疫苗组和未免疫疫苗组的平均发病率分别为8.2%和29.2%、5.7%和27.6%、4.1%和26.3%。

图8 PEDV RT-PCR检测结果

3 讨论

动物传染病必须同时具备传染源、传播途径和易感动物等3个基本环节，方能构成流行[10]。PEDV感染后以7日龄内仔猪死亡率最高，随年龄增加逐步降低，应及时淘汰发病仔猪，清除传染源。当前PEDV流行毒株的变异使得商品化疫苗无法产生有效保护，“返饲”具有一定临床效果，但存在严重散毒风险，因此仅依赖疫苗免疫来保护易感猪的策略在较长一段时间内难以实现。将吮乳仔猪寄养给健康母猪或人工哺乳，发病率和死亡率均显著降低，说明通过技术隔离切断其传播途径，可有效降低PED的临床危害[11]。由于PEDV的抵抗力较弱，2%氢氧化钠、1%福尔马林和1%碘仿等传统消毒剂都可将其杀灭，但均具有作用时间短和对皮肤及黏膜有强刺激性等缺点。香连溶液则是一种纯天然中药消毒剂，具有较强的抗病原体作用，且气味清香，刺激性小、无毒和无腐蚀作用。本试验中，将香连溶液作50倍稀释时，对Vero细胞的生长没有明显影响，提示对母猪使用时较为安全，50～100倍稀释时，对PEDV有明显的抑制作用，因此建议在猪场进行消毒时，可将香连溶液作50～100倍稀释后使用。对初生仔猪灌服香连溶液和其他消毒剂后，全部发病死亡，证实该措施无法阻止PEDV感染，其原因应为PEDV的感染剂量极低，但先灌服香连溶液后可使其病程有所延长，也有力的佐证了香连溶液可抑制PEDV增殖这一结论。

母猪乳房的结构特点，使其形成明显的“定期放乳”这一独特泌乳方式[12]，在产后最初几天内，一昼夜放乳次数约为24～25次。PEDV随病猪和带毒猪的粪便排出，主要污染母猪乳头通过“粪-口途径”感染[13]。本试验中发现香连溶液的消毒时效性为2 h内，应为每昼夜消毒12次，但工作量巨大，产房护理人员难以承受。鉴于此，进一步研究发现，每昼夜消毒6次，同时通过及时清除粪便和产床喷雾消毒5～6次，可使PED的发病率控制至30%以内。另外，免疫疫苗同时配合乳头消毒试验组的发病率仅为2.8%，提示该模式是当前国内猪场有效防控PEDV感染的最有效措施。临床推广试验结果表明，不同规模的猪场应用该模式均可有效阻断PEDV的大面积感染，其中，规模化猪场和中小型猪场平均发病率均略高于养猪专业户，这应与后者多为家庭式猪场，操作者责任心较强，乳头消毒措施实施到位有一定关系。

综上所述，本研究所构建的“母猪产前免疫PED疫苗配合产后使用香连溶液擦拭乳头消毒”模式不仅可以有效阻断PEDV的大面积感染，降低发病风险，提高猪场经济效益，同时有利于我国绿色食品的发展，逐渐杜绝含抗生素和化学消毒剂残留的食品上市销售，并可进一步扩大其技术应用范围，为猪腹泻性疫病的综合防控工作探索出一条行之有效的技术思路。

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