半自动化结核杆菌扫描仪与萋-尼法人工镜检对分枝杆菌的诊断价值

岳永宁，张艳，胡钰卿，李浩，陈园园，鲍志坚

（杭州市红十字会医院，浙江 杭州 310003）

痰涂片检查一直以来都是临床诊断结核病重要的诊断依据，涂阳肺结核患者的检出仍然是我国实施结核病防治规划的重要手段。目前痰涂片镜检标准化方法为萋-尼法，此方法要求镜检工作人员用100倍油镜观察50~300个不同视野，需花费很长时间，有可能造成漏检。而半自动化结核杆菌扫描仪大大减轻了结核检验人员的工作量，节省了人力成本。为检验结核杆菌扫描仪的应用效能，本研究通过该仪器检测了225例疑似肺结核患者的痰标本225张，同时与人工镜检法相比较，以罗氏培养（L-J培养法）为金标准，研究其对分枝杆菌检出的敏感度和特异度，探讨结核杆菌扫描仪的应用前景。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择2017年4月于浙江省结核病诊疗中心首次住院患者，按照临床症状和体征、以及系列相关检测疑似为肺结核的患者225例。收集患者未用抗结核药物前的痰液标本2~5mL，制作痰涂片一张用于萋-尼染色法人工镜检和半自动化结核杆菌扫描仪镜检。剩余痰液标本进行L-J培养法检测。

1.2 仪器与试剂 （1）仪器：光学显微镜为日本奥林巴斯CX21，采用100倍油镜观察。结核杆菌扫描仪JHSMY （上海皓信生物技术有限公司）。（2）试剂：萋-尼染色法染色液由上海皓信生物技术有限公司提供。酸性罗氏培养基由珠海贝索生物技术有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 痰涂片抗酸染色镜检 （1）取痰标本的脓性，干酪样部分约0.05~0.10mL，于玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成面积约为10mm×20mm的椭圆形痰膜。用于萋-尼抗酸染色，萋-尼染色按《中国结核病防治规划痰涂片镜检质量保证手册》的标准[1]进行。（2）由1名经验丰富的工作人员用生物显微镜进行镜检，用100倍的油镜从左至右观察，每行观察100个视野，观察三行共300个视野。在蓝色背景下分枝杆菌呈红色杆状。结核杆菌扫描仪每次扫描5张痰片，扫描范围为痰片中心300个不重复视野，筛查可疑视野，最终按《中国结核病防治规划痰涂片镜检质量保证手册》的标准[2]进行人工确认。

1.3.2 L-J培养 将1～2倍的4%氢氧化钠（NaOH）溶液加入标本中，用涡旋振荡器振荡，直至痰液标本充分液化，室温静置15分钟后，吸100mL处理好的痰液标本于培养基斜面上，放入（36±1）℃的孵箱内孵育。接种后第3和7天观察培养情况，此后每周观察1次，至第8周末后未生长的判为阴性[2]。

1.4 质量标准 萋-尼染色液和酸性罗氏培养基均采用分枝杆菌标准菌株H37Rv进行染色和生长试验验证，酸性罗氏培养基经24小时无菌测试合格后使用。萋-尼染色及罗氏培养过程中均同时采用阴阳性对照进行质量控制，其中萋-尼染色采用灭活的标准菌株H37Rv混合在阴性痰标本中制备成涂片作阳性对照，正常人痰液作阴性对照。罗氏培养则采用H37Rv结核分枝杆菌标准菌株作阳性、高压后无菌去离子水作阴性对照。

1.5 统计学处理 采用SPSS20.0对萋-尼染色法人工镜检和结核杆菌扫描仪镜检结果进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，尤登指数=敏感度+特异度-1。

2 结果

检测时间仪器镜检组为（2.0±0.0）分钟，人工镜检为（4.8±0.8）分钟，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。以罗氏培养法检测结果为诊断结核病的金标准，仪器镜检与人工镜检的敏感度分别为55.31%（26/47） 和 42.55%（20/47）， 特异度分别为95.51% （170/178）和 99.44%（177/178），尤登指数分别为0.51和0.42。详见表1。

表1 仪器镜检与人工镜检结果比较（n）

3 讨论

萋-尼染色镜检法作为诊断结核病不可缺少的基本实验室检查，可将杆菌分为抗酸阳性杆菌和抗酸阴性杆菌。抗酸阳性杆菌是诊断分枝杆菌的有力证据。所以萋-尼染色镜检法广泛应用于结核病的诊断[3]。传统的萋-尼染色镜检法为人工显微镜检查，存在费时、费力、阳性率低等缺点，而作为分枝杆菌金标准的罗氏培养法其检测周期较长。半自动化结核杆菌扫描仪在缩短镜检时间方面具有很大的优势，按规程要求，人工镜检每个工作日读片不能超过25张，且连续读片10~12张后应休息20分钟左右，故每天读片量受到限制。半自动化结核杆菌扫描仪可以不间断进行镜检，大大提高了读片量和工作效率。

以罗氏培养检测结果为金标准进一步分析萋-尼染色法人工镜检与半自动化结核杆菌扫描仪的诊断效能，仪器镜检与人工镜检的敏感度分别为55.31%和42.55%，特异度分别为95.51%和99.44%，尤登指数分别为0.51和0.42，仪器镜检的诊断效能均高于人工镜检。但与罗氏培养检测结果比较，萋-尼染色法检测的敏感度较低[4]，特异度则较高。

本文225例中有14例两种镜检方法检测结果不一致，其中1例人工镜检为阳性而半自动化结核杆菌扫描仪镜检为阴性，13例人工镜检为阴性而半自动化结核杆菌扫描仪镜检阳性。分析其原因发现，14例镜检结果阳性级别较低（1~3条）。半自动化结核杆菌扫描仪只对涂片中心位置进行300视野的镜检，所以阳性级别较低的涂片可能会因为视野的盲区而导致漏检。如果改进技术，对痰涂片做全片扫描镜检，就完全可以降低其漏诊率，提高诊断分枝杆菌的准确率。人工镜检未检出原因可能是镜检人员出现视觉疲劳，导致漏检。

综上所述，半自动化结核杆菌扫描仪镜检比人工镜检有优势，该技术大大缩短了镜检的时间，减轻了工作量，最重要的是，此法较人工镜检有更高的敏感度和特异度。故半自动化结核杆菌扫描仪可用于结核实验室对痰涂片的筛查，对分枝杆菌的诊断比萋-尼染色法人工镜检更有价值。

[1]中国疾病预防控制中心.中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册.北京：中国协和医科大学出版社，2009：7

[2]赵雁林.分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册.北京：人民卫生出版社，2013：4

[3]张登才，刘斌，张丽华.等.抗酸染色在结核病病理诊断中的价值.中国防痨杂志，2014，36（4）：274

[4]Van Deun A，Hamid Salim A，Aung KJ，et al.Performance ofvariations of carbolfuchsin staining of sputum smears for AFBunderfieldeonditions.IntJTubercLungDis，2005，9（10）：1127