八角茴香挥发油超声辅助提取及抗氧化性研究

谢志新，陈琳琳，张文州，William Chandler

(1.泉州医学高等专科学校 药学院，福建 泉州　362000；2.美国泰森食品有限公司，上海　200021)

八角茴香，别名八角大茴、大八角、大茴香等，系木兰科八角属植物八角茴香的干燥成熟果实，主要分布在广西、云南等省份，为我国的特产辛香料和中药[1]。八角茴香富含挥发油、糖苷类、黄酮类、莽草酸等多种天然活性成分，其中挥发油含量最高，约占5%～8%[2]，八角茴香挥发油气味芳香持久、味甜，常作为辛香料广泛用于牙膏、香皂、甜香酒等行业，是食品行业、化学工业的重要原料。中医理论认为八角茴香油具有温阳散寒、理气止痛的功效，用于治疗寒疝腹痛、肾虚腰痛等。近年来有研究表明八角茴香还具有广谱的抗菌作用，抗疲劳、抗氧化等功效[3-6]。因此，八角茴香挥发油还可作为抑菌剂用于医学或制药行业，也可作为天然保鲜剂广泛用于食品保鲜，避免被氧化变质[7]。

目前，国内外八角茴香油的提取方法主要有水蒸气蒸馏法[8]、超临界CO2提取法[9]、溶剂萃取法[10]、超声波辅助萃取法等[11]，不同的提取方法得到的挥发油产率和质量都不一样。由于水蒸气蒸馏法提取时间长、提取率低，而超临界CO2萃取法也由于设备昂贵、生产成本高导致其工业化的应用受限。超声波辅助提取法由于超声波可加速中药有效成分的溶解、扩散，具有操作简单、提取率高和提取时间短等优点；同时在整个提取过程中温度升高不显著，从而能更好地保持挥发油特有的风味[12,13]。因此，本实验选取超声波辅助乙醇提取法进行研究，以料液比、粉碎粒径、超声时间3个因素进行正交优化试验，以获得提取挥发油的最佳工艺参数，同时测定其对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除能力，并与维生素C标准品作对照，研究其体外的抗氧化活性，从而使八角茴香应用价值得到更有效的利用。

1　材料与仪器

1.1　材料

八角茴香：购于泉州市东南医药连锁公司，经泉州医学高等专科学校生物学专业黄秀珍教授鉴定。

1.2　主要仪器和试剂

1.2.1仪器

FA2004电子分析天平上海良平仪器仪表有限公司；VCX500超声波细胞破碎仪美国SONICS公司；DK450B恒温水浴箱上海森信实验仪器有限公司；DXF-20D高速万能粉碎机广州大祥电子机械设备公司；DHG-9140A鼓风干燥箱上海一恒科学仪器公司；752紫外可见分光光度计上海光谱仪器厂。

1.2.2试剂

95%乙醇冰乙酸(AR，西陇化工有限公司)；维生素C标准品(上海江莱生物科技公司)；羟自由基测试盒、抗超氧阴离子自由基测试盒(南京建成生物研究所)；DPPH(BR，Sigma公司)。

2　试验方法

2.1　单因素试验

2.1.1料液比因素的考察

将八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，过60目药筛，精确称取未浸泡和超声处理的药材粉末10.000 g，共5份，装入滤纸筒中，搭好索氏提取装置，分别加入1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的95%乙醇，用电热套加热30 min，收集乙醇提取液，浓缩得八角茴香挥发油，称重并计算提取率,提取率(%)=m1/M2×100。式中：m1为八角茴香挥发油质量(g)，M2为八角茴香药材粉末质量(g)。

2.1.2粉碎度因素的考察

在已经确定的最佳料液比基础上，将八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，分别过20，40，60，80，100目的药筛，精确称取未浸泡和超声处理的药材粉末10.000 g，共5份，分别装入滤纸筒中，搭好索氏提取装置，按1∶20的料液比加入95%乙醇，用电热套加热30 min，收集乙醇提取液，浓缩得八角茴香挥发油，称重并计算提取率,提取率(%)=m1/M2×100%。式中：m1为八角茴香挥发油质量(g)，M2为八角茴香药材粉末质量(g)。

2.1.3超声时间因素的考察

在已经确定的最佳料液比、最佳粉碎粒径基础上，将八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，药筛，精确称取未浸泡的药材粉末10.000 g，共5份，分别装入密闭容器中，加入约100 mL的95%乙醇，置于超声波细胞破碎仪上超声，功率为200 W，时间分别为10，20，30，40，50 min，之后分别装入滤纸筒中，搭好索氏提取装置，按1∶20的料液比加入95%乙醇，用电热套加热30 min，收集乙醇提取液，浓缩得八角茴香挥发油，称重并计算提取率，提取率(%)=m1/M2×100。式中：m1为八角茴香挥发油质量(g)，M2为八角茴香药材粉末质量(g)。

2.2　测定方法

2.2.1羟自由基清除率的测定[14]

利用羟自由基测定试剂盒，利用Fenton反应体系，采用分光光度法对羟自由基清除率进行测定，清除率(%)=(A对照-A样品)/A对照×100。式中：A对照为底物应用液的吸光度， A样品为样品试验组的吸光度。

2.2.2超氧阴离子自由基清除率的测定

利用抗超氧阴离子自由基测试盒，利用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶反应系统，采用分光光度法对超氧阴离子自由基清除率进行测定，清除率(%)=(A对照-A样品)/A对照×100。式中：A对照为蒸馏水及试剂应用液的吸光度，A样品为样品试验组的吸光度。

2.2.3DPPH自由基清除率的测定

参考Capek等[15]的试验方法并进行适当改进， DPPH自由基清除率=[1-(As-Ab)/Ac]×100。式中：As为样液试验组的吸光度，Ab为样液本底组的吸光度，Ac为空白对照组的吸光度。

2.2.4试验数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2007等软件进行数据处理与统计分析。

3　试验结果与分析

3.1　八角茴香挥发油提取单因素试验结果

3.1.1料液比对挥发油提取率的影响

表1　料液比因素考察结果Table 1 The solid-liquid ratio factor investigation results

由表1可知，随着料液比的增加，提取率呈上升趋势，在1∶20时挥发油提取率达到最高，当料液比再增加时提取率不升反降。因此，综合考虑提取效果和溶剂用量选择料液比为1∶20。

3.1.2粉碎粒径对挥发油提取率的影响

表2　粉碎粒径因素考察结果Table 2 The crushing particle size factor investigation results

由表2可知，挥发油的提取率并不是随着粉碎粒径的增加而升高，即药材并不是粉碎得越细越好，而是粉碎到能过60目药筛时达到高峰，这主要是因为药材粉碎过细可导致油室或油细胞破碎过多，在粉碎过程中造成挥发油的损失。因此挥发油提取的最佳药材粉碎粒径为60目。

3.1.3超声时间对挥发油提取率的影响

表3　超声时间因素考察结果Table 3 The ultrasonic time factor investigation results

由表3可知，挥发油的提取率在超声30 min时达到高峰，随着超声时间的延长，提取率时高时低，但均未超过30 min时的高峰值。因此挥发油提取的最佳超声时间为30 min。

3.1.4超声波辅助提取挥发油的工艺优化

根据料液比、粉碎粒径、超声时间单因素的试验结果，选取3个水平，进行正交试验设计，正交试验因素水平表及试验结果分别见表4和表5，以提取率为考察指标，研究各因素对提取率的影响，从而确定最佳提取工艺参数。

表4　超声波辅助法提取因素水平表Table 4 The factors and levels of ultrasonic-assisted extraction method

表5　超声波辅助提取法正交试验设计与结果Table 5 The orthogonal experiment design and results of ultrasonic-assisted extraction method

由表5可知，极差RA>RB>RC，即各因素对挥发油提取的影响程度为药材的料液比>粉碎粒径>超声时间；再通过K值的比较分析可知：KA1>KA3>KA2，KB2>KB1>KB3，KC2>KC3>KC1，即A1B2C2是挥发油提取的最优组合。因此，基于以上的分析可确定超声波辅助乙醇提取法的最佳提取工艺条件为料液比1∶15、粉碎粒径60目、超声时间30 min、提取率28.501%，得到的挥发油为浅褐色的膏状物，略带粘稠，具有八角茴香芳香气味。

按正交试验表所得的最佳提取工艺条件，平行提取3次，提取率分别为28.316%，28.487%，28.512%，均值为(28.438±0.11)%。

3.2　清除羟自由基的能力

图1　维生素C标准品与八角茴香挥发油对羟自由基的清除能力Fig.1 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to hydroxyl free radical

由图1可知，八角茴香挥发油和维生素C标准品对羟自由基均有较好的清除效果，且清除能力随着浓度的增加而逐渐加强，同时在一定浓度范围内具有良好的线性关系，线性方程分别为y=3.7119x+31.655，R2=0.9818；y=316.99x+43.496，R2=0.9924，其半数清除率IC50分别为4.9422，0.0205 mg/mL，当八角茴香挥发油浓度为12.00 mg/mL时清除率与维生素C标准品0.12 mg/mL的清除率相当，可达78.56%。羟自由基是高反应性的自由基，其反应距离短、速度快、攻击力强，是组织细胞衰老、炎症、心脑血管疾病的重要诱导因素之一。八角茴香挥发油对羟自由基的高清除效果能起到很好的抗氧化、抗炎作用。

3.3　清除超氧阴离子自由基的能力

图2　维生素C标准品与八角茴香挥发油对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.2 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to superoxide anion free radical

由图2可知，八角茴香挥发油和维生素C标准品对超氧阴离子自由基的清除能力随着浓度的增加而呈上升趋势，在测定的浓度范围内两者均有较好的线性关系，线性方程分别为y=4.7792x+12.487，R2=0.9914；y=164.3x+10.058，R2=0.9934，其IC50分别为7.8492，0.2408 mg/mL。超氧阴离子自由基本身虽不直接诱导生物和食品体系的脂类氧化，但可以通过连锁反应产生高活性的羟自由基，因此，通过对超氧阴离子自由基的清除也能达到抗氧化作用。

3.4　清除DPPH自由基的能力

图3　维生素C标准品与八角茴香挥发油DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to DPPH free radical

由图3可知，八角茴香挥发油和维生素C标准品对DPPH自由基也表现出一定的清除能力，但是清除效果均不理想，八角茴香挥发油浓度为6.00 mg/mL时清除率与维生素C标准品0.200 mg/mL的清除率相当，仅为49.46%左右；在低浓度范围内八角茴香挥发油的清除效果甚至优于维生素C标准品。在测定浓度间两者均具有明显的剂量效应，线性方程分别为y=4.5894x+21.555，R2=0.9914；y=187.46x+7.8784，R2=0.9897其IC50分别为6.1980，0.2247 mg/mL。

3.5　八角茴香挥发油与维生素C标准品的抗氧化性比较

图4　八角茴香挥发油与维生素C标准品对自由基半数清除率的对比图Fig.4 The comparison of IC50 of star anise volatile oil and vitamin C standard

由图4可知，通过比较八角茴香挥发油及维生素C标准品对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的IC50，八角茴香挥发油虽然对各种自由基均有较好的清除作用，但是其IC50均低于维生素C标准品，这可能跟挥发油未经过分离纯化，里面含有一些没有抗氧化活性的物资有关，如果经过纯化后，可能表现出更好的抗氧化效果。通过比较IC50可知，八角茴香挥发油对3种自由基的清除能力大小依次为羟自由基>DPPH自由基>超氧阴离子自由基。

4　结论

超声波辅助法的最佳提取工艺参数为料液比1∶15、粉碎粒径60目、超声时间30 min、提取率(28.438±0.11)%，所得到的挥发油为浅褐色的膏状物，略带粘稠，味浓厚。八角茴香油是重要的药食同源物资原料，在医药、化工及食品加工等领域具有广泛的应用前景，因此其提取工艺及优化也将受到人们更多的关注。由于中药材的提取受到诸多因素的影响，如药材与溶剂的比例(即料液比)、药材粉碎粒径、浸泡时间、提取时间、温度和提取工艺等。因此加强这些方面的研究，可以对其有效成分进行更好的提取、分离、纯化，从而提高挥发油的纯度。

八角茴香挥发油在测定浓度范围内对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基均具有良好的清除作用，且其清除能力与样品的浓度呈现明显的剂量-效应关系。赵秀玲[16]的研究表明八角茴香油的抗氧化性可能与大茴香醛、大茴香脑有关，提取物可能通过清除油脂氧化反应生成的自由基来抑制链式反应以实现抗氧化作用。本试验仅是从体外通过IC50来初步判断八角茴香挥发油对3种自由基的清除能力，结果表明均具有一定的清除效果，而自由基的清除是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机制[17]。因此，八角茴香可作为一种较好的天然抗氧化剂、抑菌剂和保鲜剂的重要原料。今后将加强其在抗氧化、抑菌作用等方面的研究，从而为八角茴香的深加工和系列产品的开发提供一定的理论基础，最终提高产品的附加值。

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