非小细胞肺癌患者血清miR-141及miR-224的表达及其临床意义

林文科，吴吉芳，郑志昂

(海南省第三人民医院检验科，海南三亚　572000)

1　材料和方法

1.1研究对象选取2015年1月～2017年6月海南省第三人民医院经手术病理证实的NSCLC患者128例，其中男性82例，女性46例，年龄43～76岁，平均年龄58.4±9.7岁。纳入标准：①符合国际抗癌联盟(UICC)与2009年制定的最新版肺癌的诊断和分期标准，且经病理确诊为NSCLC者；②术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗者；③未并发其他肿瘤者。临床病理分期：I期16例，Ⅱ期50例，Ⅲ期34例，Ⅳ期28例；病理类型：鳞癌68例，腺癌51例，大细胞癌9例；病理分级：G1 28例，G2 47例，G3 53例；有淋巴结转移77例，无淋巴结转移51例。选择同期良性病变(如肺结核、炎性假瘤和各种肺部良性肿瘤等)患者60例作为良性组，其中男性39例，女性21例，年龄45～77岁，平均年龄60.2±10.4岁；60例健康体检者作为对照组，其中男性37例，女性23例，年龄40～75岁，平均年龄56.8±9.3岁。各组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，并签署患者知情同意书。

1.2主要试剂和仪器RNA提取试剂盒购自美国Ambio公司，在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)。C1000梯度PCR扩增仪(BIO-RAD公司)和5810R高速冷冻离心机(Eppendorf)。

1.3Real-Time PCR检测空腹取静脉血5 ml于EDTA抗凝管中，3 000 r/min，离心15 min后取上清，收集上清液于无RNA酶的2 ml离心管，所有标本置于-80℃冰箱保存。按照总microRNA快速提取试剂盒(miRNeasy血浆提取试剂盒)说明书从中提取总microRNA。以U6为实验内参，microRNA逆转录反应体系：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μl 100 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μl逆转录酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反转录缓冲液，0.19 μl RNase抑制剂(20 U/μl)，4.16 μl无菌三蒸水。PCR总反应体系为15 μl，反应条件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min。以U6为实验内参，反应体系为20 μl：1 μl引物及探针Mix(20×)，10 μl TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μl反转录产物cDNA，7．67 μl 无核酸酶的水。扩增条件为：95℃10 min 1个循环，95℃15 s，60℃60 s进行45个循环，实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到所设定的阈值的经历的循环数即为Ct值，以U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-141及miR-224的相对表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.4SCC-Ag检测采用罗氏电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒，化学发光法测定SCC-Ag水平，操作过程严格按照说明书进行。

2　结果

2.1各组血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表达水平比较见表1。NSCLC组血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表达水平均明显高于良性组和对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；而良性组与对照组血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1

各组血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表达水平比较

2.2NSCLC患者血清miR-141及miR-224表达与临床病理特征的关系见表2。血清miR-141及miR-224表达水平与病理分期、病理分级及淋巴结转移相关，差异有统计学意义(P<0.05)；而与年龄、性别、吸烟状况、职业暴露、病理类型及肿瘤直径无关，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2

NSCLC患者血清miR-141及miR-224表达与临床病理特征的关系

2.3血清miR-141，miR-224及SCC-Ag对NSCLC的诊断价值见图1和表3。血清miR-141，miR-224，SCC-Ag及三项联合诊断NSCLC的AUC(95%CI)分别为0.892(0.824～0.961)，0.864(0.793～0.932)，0.785(0.718～0.849)及0.913(0.847～0.981)，与对照组(AUC=0.5)比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。血清miR-141，miR-224及SCC-Ag诊断NSCLC的最佳截值分别为1.84，2.85，2.03 ng/ml。三项联合诊断NSCLC的敏感度和特异度较好，分别为92.5%和82.7%。

表3

血清miR-141，miR-224及SCC-Ag对NSCLC的诊断价值

图1　血清miR-141，miR-224及SCC-Ag诊断NSCLC的ROC曲线

2.4NSCLC患者血清miR-141与miR-224，SCC-Ag的相关性见图2。Pearson相关分析显示，NSCLC患者血清miR-141与miR-224，SCC-Ag均呈正相关(r=0.782，=0.637，均P<0.01)；血清miR-224与SCC-Ag呈正相关(r=0.594，P<0.01)。

3讨论microRNA是一类由19～22个成熟核苷酸组成的小分子非编码RNA，在肿瘤的发生、发展和转移中起着重要的作用，在晚期肿瘤患者血液中也检测到异常microRNA的表达，有望成为治疗肿瘤患者的重要靶点[7]。已有研究证实，microRNA可以稳定存在于痰液、血清及组织中，同时发现microRNA在恶性肿瘤中的表达谱与健康人存在明显差异，这些特性使得microRNA有望成为新的肿瘤标志物[8]。Li等[9]研究表明，microRNA的异常表达与NSCLC的发生发展相关，检测肺癌组织或外周血microRNA的表达水平对NSCLC的早期诊断、临床分期及预后评估具有重要的意义。Wang等[10]采用Real-Time PCR技术检测70例NSCLC患者和70例健康对照组血清miR-125a-5p，miR-145及miR-146a表达水平，结果提示miR-125a-5p，miR-145及miR-146a可能成为NSCLC临床诊断的非侵入性的生物标志物。近年来研究发现，miR-141及miR-224在多种恶性肿瘤中异常表达，且不同恶性肿瘤组织miR-141及miR-224的表达谱不同，miR-141及miR-224对肿瘤早期诊断、分期和预后评估等方面具有重要的提示作用[11，12]。

图2　血清miR-141与miR-224，SCC-Ag的相关性

本研究显示，NSCLC组血清miR-141，miR-224及SCC-Ag表达水平均明显高于良性组和对照组，提示血清miR-141及miR-224在NSCLC患者中异常表达，可能通过发挥癌基因的作用来调节NSCLC的发生发展过程。在NSCLC患者临床病理分期中，Ⅲ～Ⅳ期患者血清miR-141及miR-224的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期；miR-141及miR-224的表达随着病理分级的增高而降低，高分化患者明显低于低分化患者；有淋巴结转移患者血清miR-141及miR-224的表达水平明显高于无淋巴结转移患者。分析其原因可能是存在淋巴结转移的患者肿瘤负荷往往较大，肿瘤组织可释放更多的具有原癌基因作用的microRNA进入血液，同时可抑制机体原有的具有抑癌作用的microRNA水平表达，进而导致机体microRNA表达水平异常升高。Mei等[13]研究发现，miR-141通过调节pH结构域富含亮氨酸重复序列蛋白磷酸酶-1(PHLPP-1)和(PHLPP-2)表达在NSCLC的发生中发挥着重要的作用，并为NSCLC治疗的潜在治疗靶点。Wang等[14]采用Real-Time PCR技术检测56例NSCLC患者miR-224的表达情况，并分析其与NSCLC的临床病理特征的关系，发现miR-224通过调节RASSF-8表达促进NSCLC细胞的增殖，可能是NSCLC的潜在治疗靶点。因此，miR-141及miR-224在一定程度上参与NSCLC的发生发展，有望作为NSCLC的生物学标志物或治疗靶点。

尽管国外已有报道miR-141及miR-224可作为NSCLC的生物学标志物，但二者联合传统肿瘤标志物诊断NSCLC的研究尚未发现。本研究中miR-141及miR-224联合SCC-Ag诊断NSCLC有较高的诊断价值，其敏感度和特异度为92.5%和82.7%。在单项中miR-141诊断NSCLC的敏感度和特异度较好，为87.4%和84.5%，其最佳截值为1.84。Liu等[15]研究表明，血清miR-141可能成为NSCLC诊断的潜在的新型生物标志物。张洪岩等[16]采用Real-Time PCR技术对31例NSCLC组织及癌旁正常肺组织的miR-224进行定量分析，结果表明miR-224有可能作为NSCLC的重要肿瘤标志物。Yang等[17]研究发现，多种microRNA联合诊断NSCLC的价值较高，其AUC高达0.970，这些microRNA在NSCLC筛查中具有广阔的应用前景。另有研究认为，microRNA的高表达与NSCLC的生存率及致癌作用显著相关，可作为预测NSCLC预后的潜在生物标志物[18]。相关分析显示，NSCLC患者血清miR-141与miR-224呈正相关(r=0.782，P<0.01)，提示miR-141和miR-224联合检测有助于提高NSCLC诊断的准确性。Wang等[19]研究也表明，5种血清microRNA联合检测对诊断NSCLC具有较高的价值，其AUC(95%CI)高达0.976(0.939～1.000，P<0.001)。虽然本研究中miR-141及miR-224对NSCLC的诊断效能优于传统的肿瘤标志物(SCC-Ag)，但若要应用于临床，仍需要扩大样本量，找到每个分类或者分型的标志物将更有助于NSCLC的诊断。

综上所述，血清miR-141及miR-224相比于传统的肿瘤标志物有较高的特异度和敏感度，且与患者的临床病理特征相关，有望作为诊断NSCLC的新型生物标志物，与SCC-Ag联合应用可提高NSCLC诊断的准确性。

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