儿童呼吸道合胞病毒感染血清特异性抗体IgM，IgG和IgA表达的相关性研究

吴　意，金　娴，樊春卉，侯家兴，赵　毅

(深圳市第七人民医院检验科，广东深圳　518081)

呼吸道合胞病毒(RSV)是一种世界范围内广泛流行，能引起婴幼儿严重下呼吸道感染及威胁婴幼儿生命健康的病原菌。同时也是医院内感染的主要病原体之一[1]。主要引起支气管肺炎和急性支气管肺炎[2]。RSV感染的实验室辅助诊断指标主要以抗原、抗体检测为主，但多数以RNA的检测作为临床诊断依据。为了寻找RSV的特异性抗体，此次研究做了如下实验。

1　材料和方法

1.1研究对象从2015年10月～2017年5月因呼吸道感染在深圳市第七人民医院儿科住院治疗的儿童中筛选出咽拭子RSV-RNA阳性50例患儿。年龄为10天～10岁，男性患儿23例，女性患儿27例。根据临床疾病诊断标准，按临床症状、影像学和体征三者结合共确诊四种疾病分别为急性喉气管支气管炎、支气管肺炎、急性支气管炎和急性上呼吸道感染。选取95例无呼吸道感染症状的儿童血清标本作为对照组。男性48例，女性47例，年龄为58 min～10岁。

1.2仪器和试剂微量加样器购于德国Eppendorf公司；漩涡振荡混匀器购于美国Vortex公司；C1301型迷你离心机购于美国Labnet公司；BSC-1100A2X型生物安全柜购于济南鑫贝西公司；DW-FL253低温冰箱购于中科美菱低温科技股份公司；Mastercyclerep realplex2荧光定量PCR仪购于德国Eppendorf公司；DK-8B型恒温水育箱购于上海精宏实验设备有限公司；RT-6000酶标仪购于深圳雷杜生命科学股份有限公司。RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA试剂盒购于德国维润赛润研发有限公司；RSV试剂盒购于中山大学达安基因股份有限公司。

1.3方法

1.3.1样本的收集：用鼻咽拭子取患者咽部分泌物，将标本密封立即送检，运送采用0℃冰壶。标本不能及时检测可保存于-20℃，保存期为12个月。同时留取该患儿血清标本和无呼吸道感染症状的对照组血清标本。

1.3.2样本RSV-RNA的提取：严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.3PCR扩增筛选阳性标本：RSV加10 μl RNA模板于RSV的PCR试剂盒反应管内，高速离心数秒后上机进行PCR扩增。PCR的扩增循环条件为：首先40℃ 30 min，94℃ 3 min，然后93℃ 15 s，55℃ 45 s共10个循环，最后93℃ 15 s，55℃ 45 s共30个循环，采集荧光信号。结果分析及质量控制：每次实验设置阴性质控品、强阳性质控品和临界(弱)阳性质控品作为质量控制，保证实验结果的准确可靠性。RSV阴性质控品荧光信号无增长，且无明显S型扩增曲线；RSV强阳性和临界阳性质控品荧光信号增幅明显，呈典型S型扩增曲线；且RSV强阳性质控品CT值在9～12范围，临界阳性质控品CT值在17～20范围，此三项要求必须在同次实验中同时满足，否则实验无效，需重新检测。

1.3.4RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA检测：RSV-IgM检测先在800 μl稀释液中加入10 μl标本和200 μl RF吸附剂，摇匀后室温放置15 min，使其充分反应；RSV-IgG和RSV-IgA检测先在1 000 μl稀释液中加入10 μl标本，充分混匀。取上述100 μl稀释后的标本，阳性对照品(2孔)和阴性对照品(1孔)，分别加入相应的抗体酶标板孔内，留空白对照1孔(不加任何液体)；将加样后的酶标板轻微震荡，放置37℃水浴箱中孵育60 min；每孔注入稀释后的洗涤液300 μl，静置20～40 s后快速吸掉或倒掉洗涤液，共洗涤4次，将酶标板放在吸水纸上拍干；除空白孔对照孔外，每孔加100 μl酶标结合物；将酶标板放置37℃孵育箱中，孵育30 min；再次洗板，操作步骤同上述洗板一致；每孔加100 μl底物溶液(含空白对照孔)，将酶标板放置37℃孵育箱中，避光孵育30 min；每孔加100 μl终止液(含空白对照孔)，终止显色反应；在加终止液后的1 h内进行判读结果(A值)，该测试为双波长(测定波长为405 nm，参考波长为620～690 nm范围内的任一波长)。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4统计学分析采用卡方检验对结果进行统计学分析，应用SPSS11.0统计软件进行数据处理，以P<0.05为差异有统计学显著性意义。

2　结果

2.1RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA在不同组别中的阳性率分布情况实验组IgM，IgG，IgA及三者同时出现的阳性率分别是24.00%(12/50)，60.00%(30/50)，22.00%(11/50)和16.00%(8/50)，差异有统计学意义(χ2=28.19，P<0.01)；对照组IgM，IgG，IgA及三者同时出现的阳性率分别是8.42%(8/95)，94.74%(90/95)，14.74%(14/95)和0.00%(0/95)，差异有统计学意义(χ2=264.54，P<0.05)。IgM和IgG在实验组与对照组之间差异均有统计学意义(χ2=6.69，27.70，均P<0.05)；IgA差异无统计学意义(χ2=1.21，P>0.05)。

2.2RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA在不同性别及组别中的阳性率分布情况见表1。不同性别在同一实验组或对照组中各抗体阳性率差异无统计学意义(χ2=0.10，P>0.05)；同性别在实验组与对照组之间各抗体阳性率差异有统计学意义(χ2=9.16，P<0.01)。

表1

RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA在不同性别

2.3不同疾病组中RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA的检出率情况在急性喉气管支气管炎中均未检测到RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA；在急性上呼吸道感染中仅检测到1例IgG阳性；在支气管肺炎及急性支气管炎中特异性抗体IgM，IgG，IgA，IgM+IgG，IgG+IgA和IgM+IgG+IgA六种不同组合模式的检出率分别为3.45%(1/29)，41.38%(12/29)，0%(0/29)，3.45%(1/29)，3.45%(1/29)，17.24%(5/29)和5.88%(1/17)，23.53%(4/17)，0%(0/17)，5.88%(1/17)，11.76%(2/17)，17.65%(3/17)。IgM，IgG和IgA在支气管肺炎中差异有统计学意义(χ2=24.06，P<0.05)，在急性支气管炎中差异也有统计学意义(χ2=12.42，P<0.05)。

2.4RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA在不同年龄组及产生的时间段分布情况见表2。不同年龄段在7天内产生特异性抗体IgM，IgG和IgA差异有统计学意义(χ2=24.63，P<0.05)；四个年龄段患儿在21天内产生RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA仅出现在1～5岁年龄段，检出率分别为20.00%(2/10)，30.00%(3/10)和20.00%(2/10)。不同年龄段在21天内产生特异性抗体IgM，IgG和IgA差异有统计学意义(χ2=8.33，P<0.05)。

表2不同年龄段在7天内产生RSV特异性抗体的检出率分布情况[n(%)]

不同年龄段nIgMIgGIgA<6个月6～12个月1～5岁5～10岁19181030(0)6(33.33)5(50.00)1(33.33)13(68.42)6(33.33)7(70.00)3(100)0(0)5(27.78)4(40.00)2(66.67)

3讨论呼吸道合胞病毒(RSV)是一种有包膜的单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科，肺炎病毒属，有圆形和丝状两种形态。每年全球范围内RSV感染引起的婴幼儿急性下呼吸道感染(ALRTI)病例约为3 380万，感染造成死亡病例约为6.6～19.9万，其中发展中国家占99%[3]。我国5岁以下婴幼儿RSV感染病例占急性呼吸道感染住院病例的25%以上，约有40%～50%毛细支气管炎及24%肺炎是RSV感染所致[4]。

此次实验研究选取的是RSV-RNA阳性且出现临床呼吸道症状的患儿，而血清中IgM的阳性率仅为24%，说明此指标检出率与临床诊断符合率相距甚远，不宜作为早期诊断的特异性指标，且与靳庆娥等[5]报道的0.63%和解娟等[6]报道的1.36%存在较大差异，这可能与研究对象人群不同和地域不同有关。对照组中IgM存在8.42%的阳性率，说明无呼吸道感染症状的人群中存在一定的RSV隐性感染，这可能是由于其自身免疫力强、感染的病毒量少或其基因型致病力弱的原因，并未引起明显的临床症状，同时也说明IgM阳性且无任何呼吸道感染症状时，并不一定需要进行抗病毒治疗。对照组中IgG存在极高的阳性率，说明大多数儿童都是RSV的易感人群，这与靳庆娥等[5]研究成人人群感染率低的结果是相符合的，而且有研究证明半数以上儿童可多次反复感染[7]。虽然人们已经认识到适应性免疫应答在抗RSV感染中的重要性，但是固有免疫系统对病毒的早期反应也有可能决定感染的结果，所以，两者的作用都不可忽视。目前对儿童肺部固有免疫力的产生、成熟及其影响因素知之甚少，肺的固有免疫系统可能与全身免疫系统不同，其免疫机制也可能不相同。婴幼儿呼吸道上皮细胞及其对病毒感染的反应是不同于成人的，广泛的上皮细胞脱落与严重的RSV疾病相关；呼吸道上皮细胞被认为是早期细胞因子的重要来源，细胞因子的产生、黏液的分泌及上皮细胞凋亡的程度均与感染病毒株相关[8]。实验组IgM和IgA阳性检出率偏低，IgG受母婴垂直传播和继往感染的影响，容易造成漏诊和误诊，因此三者均不适合单独作为早期辅助诊断RSV感染的特异性指标。

实验研究发现不同性别在同一实验组或对照组中各抗体阳性率无明显差异性，说明特异性抗体产生不受性别因素影响；而同性别在实验组与对照组之间各抗体阳性率有明显差异性，说明此次实验选取的对象符合临床研究要求。研究中发现RSV感染主要引起儿童支气管肺炎，其次是急性支气管炎，支气管肺炎及急性支气管炎中以IgG的检出率最高，且均未单独检测到IgA。在急性喉气管支气管炎中均未检测到RSV特异性抗体IgM，IgG和IgA，仅在急性上呼吸道感染中检测到1例IgG阳性，这说明RSV感染上呼吸道较难产生各种抗体，而感染下呼吸道产生IgM和IgA的阳性率较一致。

研究发现在<6个月这个年龄段，患儿三周内都未产生IgM和IgA，而检出的IgG可能是母婴垂直传播的且对机体无保护作用，这说明年龄越小，患儿产生特异性抗体IgM和IgA的速度越慢，其原因可能是由于患儿机体免疫系统不够完善，不能及时有效地激活免疫应答所致。随着年龄的增长，一周内产生IgM和IgA的阳性率随之增长，虽然在5～10岁年龄段有所下降，这可能与所选择的研究对象人数局限性有关。在1～5岁年龄段，随着感染时间的增长，IgM，IgG和IgA平均每周提高10%左右的阳性率。这说明患儿产生特异性抗体与年龄和感染时间有一定相关性，年龄越大，感染时间越久，产生IgM，IgG和IgA的能力也随之增强，并且其抗体产生时间因个体自身免疫力存在一定差异。在5～10岁年龄段，IgA检出率最高，说明分泌型抗体在机体免疫系统越成熟时越容易产生。同时研究发现，IgA在RSV感染出现临床症状的第二天就产生，比IgM提前一天出现，是产生最早的抗体，而且不单独出现。有研究表明，儿童可以再感染相同的RSV株，但是第二次RSV感染的程度较低，表明自然感染可以产生部分保护性[9]，但不能阻止RSV再感染。

因此，以其血清学特异性抗体IgM，IgG和IgA作为RSV早期感染辅助诊断指标，存在诸多影响因素。儿童RSV感染临床诊断应该以RNA检测为金标准，结合临床症状、影像学和体征三要素。预防RSV暴发流行及院内感染，关键是在高发流行季节做好婴幼儿和学龄儿童的防护措施，及时发现、及时隔离、及时治疗、防止蔓延。

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